4.4 标本误差来源 标本误差来源包括（但不限于以下内容）： a) 采血量不当（与标示量相差超过±10%）； b) 使用非规定的抗凝剂（如EDTA盐或草酸盐）、抗凝剂的浓度、用量不准确； c) 标本有凝块、溶血、黄疸、脂血或混浊； d) 标本混匀不当，混匀不充分或剧烈混匀，产生气泡等； e) 采血器或贮血管不洁，或受到污染；使用非规定、不适当的标本采集管； f) 血细胞比容高于或等于55%； g) 急性炎症反应、纤维蛋白原升高或纤维蛋白原异常可使采用PT途径测定的凝血因子活性不准确； h) 延迟检测或使用不标准的方法处理、运送及贮存测试标本。 5 检验过程 5.1 检测系统 5.1.1 检测方法原理 5.1.1.1 一期法检测 5.1.1.1.1 检测原理：基于检测待测标本对乏因子血浆所致的凝固时间（PT 或 APTT）延长的纠正能力。将稀释后的待测血浆与乏因子血浆混合后进行 PT 或 APTT 检测，检测结果与待测血浆中的凝血因子活性呈负相关。通过使用已知凝血因子活性的血浆进行系列稀释并与乏因子血浆混合后进行 PT 或 APTT 检测建立的定标曲线，可以得出待测血浆中相应凝血因子的活性。一期法检测是目前最常用的凝血因子活性测定方法。 5.1.1.1.2 基于 PT 检测的凝血因子：因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ。 5.1.1.1.3 基于 APTT 检测的凝血因子：因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ与Ⅻ。 5.1.1.2 二期法检测 该方法适用于因子Ⅷ/Ⅸ活性检测，以因子Ⅷ活性检测为例，其原理为：基于检测因子Ⅷ作为辅因子与因子Ⅸa形成复合物活化因子Ⅹ的能力，通过检测生成的因子Ⅹa的量可计算因子Ⅷ的活性。该实验分为两步进行，第一步：待测标本与含有磷脂、钙离子、因子Ⅸa以及因子Ⅹ的试剂溶液进行孵育后生成因子Ⅹa；第二步再加入过量的凝血酶原和纤维蛋白原，检测纤维蛋白凝块形成的时间。测得的凝固时间可以通过查对已知凝血因子活性的定标曲线或代入回归方程，得到凝血因子活性。 5.1.1.3 发色底物法检测 该方法是二期法检测的改进方法，在因子Ⅷ活性检测时使用。第一步：待测标本与含有磷脂、钙离子、因子Ⅸa以及因子Ⅹ的试剂孵育后生成因子Ⅹa；第二步加入因子Ⅹa的发色底物进行检测，因子Ⅹa可作用在发色底物S2765，使其释放对硝基苯胺（paranitroaniline，pNA），后者可在405 nm波长条件下通过读取吸光度值计算该物质的生成量，通过计算转换为凝血因子活性。 5.1.2 检测系统选择 5.1.2.1 实验室宜选用仪器与试剂配套的检测系统。使用非配套检测系统时，应确认该系统是否能满足性能验证要求。 5.1.2.2 实验室在选择检测系统时，应考虑的因素（但不限于以下内容）包括： a) 临床标本性状：黄疸、脂浊等影响光散射强度的标本，适宜选择物理学检测原理的检测系统（如磁珠法）进行测定； b) 标本数量与检测速度：检测系统能够在规定时间内完成常规标本和急诊标本的测定。 5.2 试剂和耗材 5.2.1 APTT 试剂 不同APTT试剂由于激活剂的不同而对凝血因子活性检测的敏感性存在差异。检测凝血因子缺乏时，宜选用对凝血因子缺乏有高敏感性的APTT试剂（可检出凝血因子活性＜30%的标本，包括凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ等）。针对怀疑存在狼疮抗凝物的标本，宜使用对磷脂不敏感的APTT试剂盒。实验室在更换APTT试剂批号时，应进行新旧试剂的比对：根据验证标本的目标水平（验证标本应尽量覆盖检测项目的可报告范围，并至少包含正常水平和异常水平）、各水平的确定临界值、不精密度值等参数来确定所需标本数，分别采用新旧试剂进行检测，计算偏差和平均偏差绝对值，并与拒绝限进行比较，判断批号间验证是否通过。 5.2.2 PT 试剂 不同PT试剂中凝血活酶因其来源不同（可来自人、兔、牛、猴等脑或其他组织）而具有不同的敏感度。应选择敏感度高（ISI接近1）的凝血活酶试剂，实验室在更换凝血活酶试剂时，应对其ISI值进行评估。 5.2.3 乏因子血浆 乏因子血浆应符合以下要求：待测的目标凝血因子活性低于0.01 IU/mL（1%），其他凝血因子活性高于0.5 IU/mL（50%），纤维蛋白原含量高于1.0 g/L。实验室应对每个批次的乏因子血浆进行检测，以确保所用的乏因子血浆质量符合上述要求。乏因子血浆应在冷藏（冻干形式）或冰冻（贮存-70℃冰箱）条件下妥善保存。 5.2.4 定标血浆 通常使用商品化的标准血浆或校准血浆，其标示值需溯源至国际标准物质（如世界卫生组织发布的国际标准品）。若实验室自行制备定标血浆，应至少使用20例以上健康志愿者（男女各半，年龄18岁～55岁，六个月内未服用任何药物，女性未处于妊娠期或月经期）的混合血浆。血浆制备时需进行两次离心，将第一次离心获得的乏血小板血浆的上层2/3体积转移入加塞塑料试管进行第二次离心（室温、1500g、不少于15 min），注意不要使用第二次离心后的底部血浆，以确保充分去除血小板，以国际标准物质作为溯源标准确定其凝血因子活性水平，并保证凝血因子的活性在（1±0.2）IU/mL。 5.2.5 试剂误差来源 试剂误差来源包括（但不限于以下内容）： a) 试剂已被污染； b) 配制的试剂未采用 I 级试剂级水或厂家指定用水、复溶时使用非规定的稀释液、复溶时稀释液加量不准； c) 在运输或贮存过程中，因处置不当(如温度等因素)而导致试剂变质； d) 所用试剂超过了有效期或复溶后的稳定期。 5.3 定标曲线制作 5.3.1 正常值定标曲线 5.3.1.1 采用全自动血液凝固分析仪进行凝血因子活性检测时，可按照仪器生产厂商的要求预先设定参考血浆的稀释比例并使用配套参考血浆制作定标曲线。参考血浆的稀释比例应至少包括 1/10、1/20、1/40 和 1/80 四个水平。采用手工法或半自动血液凝固分析仪进行检测时，需根据不同比例稀释标本的PT 或 APTT 检测结果与对应的稀释比例在半对数或双对数坐标纸上手工绘制定标曲线。（示例见附录 A） 5.3.1.2 定标曲线的线性回归方程的 r 值应在 0.998～1.000，斜率应在
0.9～1.1。 5.3.1.3 频率：对于采用手工法或半自动方法进行凝血因子活性检测时，每批次均需建立本次的定标曲线；全自动检测方法在试剂批号更换、仪器设备调整、室内质控失控等情况下需重新建立定标曲线。 5.3.2 低值定标曲线 针对低值标本（凝血因子活性水平＜5%）应建立低值定标曲线，定标血浆可按照1/20、1/40、1/80······的比例进行稀释，其余要求同正常定标曲线的制备。 5.4 性能验证 5.4.1 性能验证一般要求 5.4.1.1 新的检测系统用于临床检测前，依据厂家说明书的要求进行校准和性能验证，至少应包括批内精密度、批间精密度、正确度和可报告范围等。 5.4.1.2 验证周期：在更换设备、组件以及试剂时需要进行性能验证。 5.4.2 重复性 重复性又称批内精密度，是以连续检测结果的变异系数（CV）为评价指标。重复精密度的验证方法：至少使用两个浓度水平（包含正常和异常水平）的新鲜临床标本或质控物进行检测，每个标本按常规方法重复检测 11 次，剔除第 1 次检测结果，计算后 10 次检测结果的变异系数。内源性凝血因子(APTT 途径) 和外源性凝血因子(PT 途径)的正常标本和异常标本的 CV 应均≤10%。 5.4.3 期间精密度 期间精密度又称为批间精密度，以室内质控检测结果的变异系数为评价指标。批间精密度的验证方法：至少使用两个浓度水平（包含正常和异常水平）的质控物或临床标本，在标本检测当天至少进行 1次室内质控，剔除失控数据后按批号或按月份，计算累计在控数据 20 次结果的变异系数。内源性凝血因子(APTT 途径) 和外源性凝血因子(PT
途径)的正常标本和异常标本的 CV 应均≤15%。 5.4.4 正确度 正确度以国际标准物质或商业校准物实际检测结果与理论值的偏倚（Bias）为评价指标。实验室应尽可能使用有证标准物质（如国际标准物质或国家标准物质）进行正确度验证，在无法得到上述标准物质的情况下，可使用商业标准物质。正确度的验证方法：将标准物质稀释至预期浓度水平（如医学决定水平）并至少重复检测10次，计算检测结果的均值与理论值的百分偏差，要求百分偏倚（Bias）应≤15%。
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