5.5 检测程序 5.5.1 标准操作程序的建立与实施 实验室应依照《医疗机构临床实验室管理办法》、本文件和仪器试剂生产厂商的操作说明制定各检测项目的标准操作程序（Standard Operation Procedure，SOP）文件，并严格按照 SOP 文件的要求进行操作。 5.5.2 检测方法的选择 因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ的活性均可使用一期法进行检测，因子Ⅷ/Ⅸ活性检测还可使用二期法和发色底物法。由于方法特性的不同，由某些特定基因突变位点导致的血友病 A 患者其因子Ⅷ:C 一期法检测结果与临床出血表现不相符，可采用二期法和发色底物法进行测定。 5.5.3 待测血浆标本的稀释要求 应根据检测的凝血因子制定相应的血浆稀释倍数，目的是为了得到一个具有可接受斜率的曲线。因子Ⅷ和Ⅸ活性检测血浆标本至少应进行 2 个稀释度的检测，有条件的实验室可进行 3 个稀释度的检测，对于低值标本可降低稀释倍数。 5.5.4 检测系统误差的来源 检测系统误差来源包括（但不限于以下内容）： a) 定标时错误输入参考血浆数值； b) 使用曲线的平台区解释结果； c) 不正确的孵育或活化时间； d) 仪器操作方法不正确； e) 仪器故障:如光源不稳定、温度波动、试剂溅出、试剂加入不准(量少)及电子干扰等； f) 稀释不正确； g) 冰冻血浆在-70℃条件下贮存超过 6 个月或者不适当的贮存环境； h) 乏因子基质血浆含有＞0.01 IU/mL(1%)的凝血活性，或含有凝血因子抑制物，或一个/多个凝血因子活性＜50%。 5.6 室内质量控制 5.6.1 质控血浆的选择：实验室可使用商业质控血浆或自制质控血浆（冰冻血浆）进行室内质量控制，质控血浆应至少具有 2 个浓度水平（包含正常水平和异常水平），使用自制质控血浆时应与商业质控血浆进行同步检测以评价其适用性。实验室应根据实际工作需要确定质控血浆的数量，避免质控血浆批号更换过于频繁。 5.6.2 频率：实验室应根据检测标本量或检测批次确定室内质控的频率，并保证每次开机检测标本前至少进行一次正常水平和异常水平的室内质控；使用新开瓶/新复溶试剂进行标本检测前，宜首先进行质控品检测。 5.6.3 质控均值和允许范围的确定：每个批号质控血浆在使用前，应由实验室通过检测确定均值和允许范围，质控品制造商规定的“标准值”和“允许范围”只能作为参考。具体方法为：将质控血浆至少检测 10 d，每天至少检测 2 次，剔除超出 3SD 外数据，输入 20 次结果完成初始化，以 20 次数据形成的均值作为当月质控图的中心线。SD、CV 在月末完成数据录入并确认后生成标值自动传递给下一月进行积累，这样每个月进行标值累积，直至累积达到指定月数（3～5 个月），计算累积均值和累积标准差，以此作为室内质控均值和标准差；室内质控建议选用 Westergard 质控规则，至少包括 13s和 22s规则，其余可根据实验室实际情况酌情选用。 5.6.4 实验室应记录结果并统计均值与标准差，绘制质控图。若发现结果失控应按步骤分析查找原因（检查试剂、质控血浆及仪器等），待各因素排查后再进行质控血浆的检测，质控结果在控后方可进行待测标本的检测。做好失控原因分析和采取的纠正措施记录。 5.6.5 实验室应定期（每月）统计室内质控结果，结果应符合 5.6.3 的要求。 5.7 室间质量评价 5.7.1 实验室应参加室间质量评价机构组织开展的室间质量评价活动，以保证采用相同实验室检测系统之间结果的可比性。 5.7.2 对于没有开展室间质评的项目应进行实验室间结果比对，以保证不同实验室之间结果的可比性。 5.8 检验结果的比对 若实验室内使用多个检测系统测定同一种分析物时，应定期进行结果比对（宜半年一次），至少使用20份临床标本（覆盖正常和低值标本）按照常规操作流程进行检测，正常浓度标本的比对偏倚应≤15%，低值浓度标本的比对偏倚应≤30%（或按照生产厂家和试剂说明书要求）。 6 检验后过程 6.1 参考区间 对于每个凝血因子，实验室可参照文献报道的参考区间进行验证后使用。若不适用，应根据所用仪器、试剂、采血方法、主要就医人群（成人或儿童）及所用抗凝剂建立适用于本室的参考区间。参考区间以相同的单位显示在每一份报告单上。 6.2 报告结果 报告前，应确定待测标本检测结果已乘以相应的稀释倍数，采用不同稀释比例测定值的平均值作为报告结果。报告单位为活性%或 IU/mL 均可，但需在检验报告中统一规范凝血因子活性报告单位及格式。 超出定标曲线值以外的结果亦可报告以大于或小于相应的可读值报告，但应与临床联系，共同确定其原因。举例说明请见附录 B。 当怀疑凝血因子存在结构异常时，可考虑检测抗原，但抗原检测不是常规检测项目，多用于科研。 6.3 结果判读误差的来源 可能的结果判读误差来源包括（但不限于以下内容）： a) 未辨认出两条曲线缺乏平行； b) 未辨认出两条曲线缺乏线性； c) 采用推断的方法得到定标曲线范围之外的数据。
附 录 A （资料性） 定标曲线手工绘制
采用手工法或部分半自动血液凝固分析仪进行检测时，需根据不同比例稀释标本的PT或APTT检测与对应的稀释比例在半对数或双对数坐标纸上手工绘制定标曲线，图应形成“S”型曲线，两端扁平，中间呈线性(图A.1，图A.2)。线性区计算所得r值应在 0.998～1.000、斜率应在 0.9～1.1 范围内。
附 录 B （资料性） 结果解读
待测血浆标本经三点稀释后形成的标本结果曲线应形成一条与工作定标曲线平行的直线。 若以上的情况不存在，应该考虑以下可能性： a)若两个或更多邻近点形成一条平行于定标曲线的直线，但没有实验结果落在可读范围之内，进一步稀释参考血浆或受检血浆则可能产生可读结果(见图B.1)； b) 若仅一个试验结果落在可读范围，同时与邻近点形成的直线不平行于定标曲线，则应稀释受检血浆，以便获得可读结果； c) 若受检血浆与参考血浆曲线不呈平行，而一个以上的结果落在已知的线性范围内，则应当怀疑标本中有抑制物存在(见图B.2)。在报告结果时，以最高稀释度报告，同时应说明标本中可能有抑制物，应做有关检查确定； d) 若所有的实验结果均落在线性范围之外，同时出现类似的试验结果(不考虑稀释所造成影响)，这个现象提示所有的试验结果均位于“S”曲线的平台区。这是典型的严重凝血因子缺乏状态(见图B.2)。
参 考 文 献 [1] Determination of Coagulation Factor
Activities Using the One-Stage Clotting Assay.2nd ed. CLSI guideline H48. Wayne
PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2016 [2] Collection, Transport, and
Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays and
Molecular Hemostasis Assays. 5th ed. CLSI document H21-A5. Wayne PA:Clinical
and Laboratory Standards Institute, 2008 [3] WFH lab manual: 2000. Diagnosis of
Haemophilia and Other Bleeding Disorders [4] Joachim JP, Michael D, Andreas H.
One-stage vs. chromogenic assays in haemophilia A.European Journal of Haematology,
2014, 94 (Sup 77):38-44 [5] Kitchen S, Signer R.K, Key NS.
Current laboratory practices in the diagnosis and management of haemophilia: a
global assessment. Haemophilia, 2015, 16:1-8 [6] Michael N, Lucas MB, Lorenzo A, et
al. Variability between laboratories performing coagulation tests with
identical platforms: a nationwide evaluation study. Thromb J, 2013,11(1):6 [7] Manuel DC. The diagnosis and
management of congenital hemophilia. Semin Thromb Hemost,2012, 38:727-734 [8] Jennings I, Kitchen DP, Woods TL,
et al. Laboratory performance in the world federation of hemophilia EQA
programme, 2003-2008. Haemophilia, 2009,15:571-577 [9] Fritsma GA, Dembitzer FR, Randhawa
A, et al. Recommendations for appropriate activated partial thromboplastin time
reagent selection and utilization. Am J Clin Pathol, 2012,137:904-908 [10] Kitchen S, John DO, Preston FE.
Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis.Wiley-Blackwell, 2008 [11] Srivastava A, Santagostino E,
Dougall A, et al. WFH guidelines for the management of haemophilia, 3rd
edition. Haemophilia, 2020, 26 (suppl 6):1-158 [12] User Evaluation of Between-Reagent
lot variation; Approved Guideline. CLSI document EP26-A. Wayne PA:Clinical and
Laboratory Standards Institute, 2013
[13] Mackie I, Cooper P, Lawrie A, et al. Guidelines on the laboratory aspects of assays used in haemostasis and thrombosis. International Journal of Laboratory Hematology, 2012,35(1):1-13 |
