5.3 试剂的来源、制备及储存 5.3.1 应记录影响检测质量的关键耗材和试剂的来源，包括制造商、供应商、购买日期、购买人、试剂批号等，且易于查询。 5.3.2 所有检测试剂应使用等级匹配的化学试剂配制，保证检测试剂达到分子生物学等级水准。 5.3.3 应按照实验室标准操作规程进行试剂配制，并进行记录。 5.3.4 所有使用的试剂应清晰标记名称、浓度、试剂特性、无菌状态、试剂保存条件、配制人、配制日期或开启日期、试剂有效期，并清晰标示试剂毒性。 5.3.5 所有使用的商业试剂的储存标准应与制造商提供的说明书相一致。 5.3.6 商业或者自制的试剂、水、溶液、培养基、质控品、校准品及其他试剂，当超过使用效期、性质改变或质量下降时，不应使用。 5.3.7 使用商业试剂盒应遵循制造商的说明书。 5.3.8 应记录每次检测使用试剂的批号或者货号。 6 样本的采集和处理 6.1 患者或被检测者信息 6.1.1 患者或被检测者的送检单信息内容应包括姓名、性别、出生日期（年龄）、采样日期、样本类型、送检医师姓名、临床相关资料或实验室检查资料，可酌情调整内容。 6.1.2 样本容器上应标注唯一性标识。 6.1.3 患者或被检测者信息表、样本、验收记录应归档保存，便于分析和追溯。 6.1.4 实验室应确保患者或被检测者信息的安全性和保密性。 6.1.5 患者或被检测者的样本被用于科研项目或商业项目时，应经过伦理审查和知情同意；如患者或被检测者样本仅进行临床检测，则无需填写知情同意书。 6.2 样本采集 6.2.1 样本采集前应明确采集方法、采集部位和保存方式，准备好采集器械。采集样本类型可为外周血、口腔拭子、骨髓细胞、唾液、组织。 6.2.2 样本采集应按照实验室操作标准进行操作，并进行记录。 6.2.3 采集样本时应注意影响样本采集和质量的因素，外周血推荐使用 EDTA 等抗凝剂，不宜使用肝素抗凝。 6.2.4 采集的样本应具有唯一性标识，并与送检单一一对应，可追溯患者姓名、出生日期、医院编号或者实验室编号、样本采集日期和采集时间。 6.3 样本运输 6.3.1 样本可以常温或普通冰袋运输，防止反复冻融和污染。 6.3.2 样本应有运输清单信息，包括样本编号、采集时间、采集实验室、采集人、样本数量、患者信息、运输容器、运输方式和保存方式等。 6.4 样本接收和验收 6.4.1 接收样本时，应做好接收验收记录，包括样本来源、类型、运输方法、运输容器、实验室接收样本的日期、样本质量和数量、附带资料等。 6.4.2 当样本信息不足、样本处理或运输不当、量不能满足检测、抗凝方式不当，实验室可以拒收样本并做好相应记录，通知送检方重新送检。 6.4.3 验收通过的样本应按实验要求进行编号并存储样本信息。 6.4.4 采集后的样本可于 4℃暂存 2 周，超出 2 周宜在-20℃以下冰箱保存。样本应避免反复冻融和相互污染，尽早提取核酸。 6.5 样本基因组
DNA 提取、检测和保存 6.5.1 样本基因组
DNA 提取 6.5.1.1 可从多种类型的样本中提取基因组 DNA，提取方法应已获得广泛认可，并经实验室验证。 6.5.1.2 提取 DNA 时应记录所有操作步骤及试剂来源，操作步骤及试剂来源的任何变动或实验过程中的任何异常现象也应记录，操作人应签字并注明实验日期。 6.5.1.3 应设有独立的 DNA 提取操作区。操作区照明和通风设备应满足实验要求，关键设备配置无中断或紧急电源，并利用物理或生化手段防止污染。区域内使用专用工作服、手套和一次性用品。 6.5.1.4 DNA 提取前应验证所有试剂质量以及 DNA 提取系统。应按照标准操作规程提取 DNA，操作手册置于便于取阅的地方。 6.5.1.5 应保留部分原始样本，不应全部用来提取 DNA，以便后续追溯和使用。 6.5.1.6 DNA 提取完成后应填写提取记录，包括样本编号、提取时间、提取操作人、提取方式、样本浓度和体积等。 6.5.2 DNA 浓度的测定 6.5.2.1 对于要求高纯度核酸的检测方法，应对获取的 DNA 进行浓度和纯度的检测，可使用分光光度计法和电泳法。 6.5.2.2 分光光度计对 DNA 浓度测定前应先校正，并设立合适的对照。DNA 样本被检测时，应保证其全部溶解且浓度均匀。核酸最大吸收波长在 260 nm，1.0 的光密度值相当于双链 DNA 含量为 50 μg/mL；蛋白质最大吸收波长在 280 nm 处，因此测定 A260/A280 比值，可判断样本中蛋白质和 RNA 污染的情况。比值在 1.8～2.0 之间，说明 DNA 纯度高；比值小于 1.6，说明样本中蛋白质残留较多；如果比值大于2.0，可能样本有 RNA 污染，建议重新抽提或纯化。 6.5.2.3 电泳法常用来判断 DNA 的完整性和 RNA 污染情况。 6.5.2.4 DNA 浓度、纯度和完整性应符合实验室使用试剂的要求。若不符合后续检测的要求，应重新抽提。 6.5.3 基因组
DNA 的保存 基因组DNA可于4℃暂存2周，超出2周宜在-20℃以下冰箱保存。-20℃保存超过1年后再使用，应先进行DNA质量评估，满足实验要求方可使用。 7 HLA 基因分型检测方法 7.1 聚合酶链反应-序列特异性引物（polymerase
chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）方法 7.1.1 基本原理 根据HLA基因序列的多态性，设计一系列等位基因特异性引物，通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据是否得到PCR产物以及产物的片段大小进行HLA基因分型。PCR-SSP的3′端引物和靶DNA特异性结合后，Taq酶使配对引物的3′端延伸，但非配对的不延伸，所以只有当靶DNA和上下游引物全部互补时才能有效扩增。PCR-SSP引物体系的特异性是通过上下游引物特异性之间的交叉来实现的。 7.1.2 检测设备及引物设计 7.1.2.1 必需的设备（包括但不限于）：96 孔 PCR 板、专用贴膜；单通道移液器、多通道移液器；96孔或 384 孔模块 PCR 仪；电泳系统及核酸片段分析系统。 7.1.2.2 基于 PCR-SSP 法的 HLA 基因分型技术，关键是准确设计特异性的引物。该引物序列应与所检测的 HLA 等位基因序列相对应，宜使用商业试剂盒。 7.1.2.3 PCR 引物和引物混合物宜分装保存。 7.1.3 结果分析及问题解决方法 7.1.3.1 总述 每个PCR-SSP反应，如果有内对照扩增，则该反应有效。如果一个反应既没有内对照又没有特异基因扩增条带，则该反应失败。如果一个反应没有内对照扩增，即使这个等位基因在该反应里被扩增了，也被视为检测失败。等位基因的型别通过阳性和阴性反应的格局来判别。单孔反应失败时，应重新进行PCR扩增反应。 7.1.3.2 常见问题的可能原因及解决方法 7.1.3.2.1 无等位基因和无内对照片段扩增 a) 检测试剂或 PCR 仪的问题，可用确认的 DNA 样本对检测试剂和 PCR 仪进行验证； b) DNA 的质量不符合要求，当 DNA 浓度太低，可以适当增加 DNA 模板量，或增加 Taq 酶量或两者同时增加； c) Taq 酶可能失效，更换 Taq 酶。实验室应正确存储和使用 Taq 酶。 7.1.3.2.2 整体扩增条带显色强度弱 a) PCR 仪的问题，用确认的 DNA 样本检测 PCR 仪； b) DNA 的质量不符合要求，参照 7.1.3.2.1 b)； c) Taq 酶质量低或过度稀释。应提高 Taq 酶浓度，确保 Taq 酶正确保存和使用。每个实验应选择合适的 Taq 酶浓度； d) PCR 相关试剂未正确保存、配制及使用，应确保每一步骤严格按照标准操作规程进行，必要时更换新的试剂。 7.1.3.2.3 单一位点出现多个等位基因扩增条带 a) 样本 DNA 受到污染，这种污染会在多个反应孔中产生额外条带，可能出现两种样本的反应格局，应重新提取样本 DNA； b) PCR 产物污染，这种污染会在单个或少数检测位点产生额外条带，应使用新的试剂进行重新扩增； c) 可能是新的等位基因，应使用其他分子生物学方法进行确认。 7.1.3.2.4 多个或所有位点出现多个等位基因扩增条带 a) 样本 DNA 受到污染，这种污染大多数会在多个或所有基因位点的反应孔中产生额外条带，可能出现两种样本的反应格局，应重新提取样本 DNA； b) PCR 仪加热系统错误，如果 PCR 程序被中断或重启（尤其是在早期阶段），可以看到多条条带，应对 PCR 仪进行检修和校准； c) 样本或 PCR 反应液受到污染，应重新采集样本或配制新的试剂进行扩增检测。 7.1.3.2.5 一个基因位点上无特异性扩增条带 a) PCR 反应液配制错误，应确保所有的 PCR 反应组份在使用前经过验证； b) 如果 dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）与 MgCl2的比例不合适，可影响一个或更多基因位点的扩增，表现出在一个特殊的位点没有等位基因，可调整 dNTP 与 MgCl2比例进行再次测试； c) 如果某些等位基因有较高的 G/C 含量，可因 Taq 酶选择不当导致难以扩增。应更换合适的 Taq酶。
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