7.1.3.2.6 有等位基因扩增条带但无内对照条带 a) DNA 降解，使分子量大的扩增条带难以产生，如内对照无扩增条带，应重新提取样本 DNA； b) PCR 延伸时间不足，应增加 PCR 反应延伸时间； c) PCR 仪故障，应重新校准 PCR 仪； d) 内对照扩增引物浓度过低，应提高引物浓度。 7.1.3.2.7 有内对照扩增条带但无等位基因条带 a) 镁离子浓度过高，应重新配制 PCR 扩增试剂； b) PCR 仪盖压力不够，应确保 PCR 仪盖和 PCR 管/板之间的压力匹配。 7.1.3.2.8 部分分型结果清晰，部分分型结果失败 a) PCR 仪加热系统故障，应确保 PCR 仪加热模块的一致性； b) PCR 管/板和 PCR 仪加热模块不匹配，应确保 PCR 管/板的底部直接接触 PCR 仪加热模块； c) PCR 仪盖压力不均匀，应确保 PCR 仪盖和 PCR 管/板之间的压力匹配； d) 凝胶电泳时核酸染料没有混合均匀或浓度不足，应重新配制凝胶或核酸染料溶液。 7.1.4 检测方法的局限性 基于已知序列信息的分型方法可能检测不到新的等位基因，或者无法与已知等位基因相区别，为避免漏检新的等位基因，当使用PCR-SSP方法时,可采用多种引物，以提高检测到新等位基因的可能性。 7.2 聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸杂交（polymerase
chain reaction-sequence specific oligonucleotide，PCR-SSO）方法 7.2.1 基本原理 PCR-SSO方法首先是对HLA的多态性区域进行扩增，然后根据碱基配对原则使用特异性探针进行杂交，根据杂交信号判断结果。基于PCR-SSO技术的HLA分型方法主要包括正相SSO方法和反相SSO方法两种。PCR-SSO技术具有灵敏度高、特异性强、加样量少的特点。 2000年后基于流式荧光检测仪Luminex平台的PCR-SSO基因分型检测系统开发成功，它利用传统PCR-SSO的原理，首先对样本的HLA多态性区域进行扩增，扩增产物经解链后与包被在微珠上的特异性探针杂交结合，通过Luminex流式荧光检测仪检测，确定HLA分型结果。该系统是整合了荧光编码微珠、激光检测、应用流体力学、高速数字信号和计算机运算法等多项技术的高通量检测平台。7.2主要针对Luminex平台的PCR-SSO HLA基因分型检测技术进行说明和要求。 7.2.2 必需的设备与耗材（包括但不限于） 96孔PCR板、96孔杂交板、96孔读取板、专用贴膜，单通道移液器、多道移液器，96孔PCR仪、Luminex分析仪，平板离心机，电泳系统及成像系统。 7.2.3 PCR 引物和杂交探针的设计 7.2.3.1 PCR 扩增引物一般至少针对 HLA Ⅰ 类基因（HLA-A, HLA-B, HLA-C）的
2 号外显子和 3 号外显子进行扩增，至少针对 HLA Ⅱ 类基因（HLA-DRB1，HLA-DQB1）的 2 号外显子进行扩增。 7.2.3.2 基于 PCR-SSO 法的 HLA 基因分型技术的关键是准确地设计特异性杂交探针，该探针序列应与所检测的 HLA 等位基因序列相匹配。 7.2.3.3 PCR 引物应于-20℃保存,包被探针的微珠应避免反复冻融、剧烈震荡，按厂家说明书要求条件保存。 7.2.4 结果分析及问题解决方法 7.2.4.1 总述 对于每个PCR-SSO反应，如果内对照杂交信号达到阈值，可认为反应有效；如内对照和特异等位基因杂交信号均未达到阈值，可认为反应失败；如内对照杂交信号未达到阈值，即使特异等位基因杂交信号达到阈值，也认为反应失败。 7.2.4.2 常见问题可能原因及解决方法 7.2.4.2.1 扩增反应失败（电泳显示无扩增条带） a) 检测试剂或 PCR 仪的问题，用确认的 DNA 样本对检测试剂和 PCR 仪进行验证； b) DNA 的质量不符合要求， DNA 浓度太低，可以适当增加 DNA 模板量，或增加 Taq 酶量或两者同时增加，如果凝胶成像显示 DNA 条带正常，可能是 DNA 纯度差的原因，需要重新提取 DNA。 7.2.4.2.2 微珠读取数量未达到阈值 a) Luminex 仪器进样针堵塞，应对仪器进行检修； b) 微珠混合不均匀，应确保每一步骤严格按照标准操作规程进行； c) 微珠的保存条件不正确，应按厂家说明书要求进行保存。 7.2.4.2.3 杂交荧光信号出现假阴性或未达到阈值 a) PCR 反应扩增失败或扩增反应弱，应参照 7.2.4.2.1 的解释； b) 杂交试剂和 Luminex 仪器的问题，用确认的 DNA 样本对检测试剂和 Luminex 仪器进行验证； c) 杂交试剂的保存、配制以及杂交后洗涤条件不当，应确保每一步骤严格按照标准操作规程进行。 7.2.4.2.4 杂交荧光信号出现假阳性 a) DNA 纯度和浓度没有达到要求，应参照 7.2.4.2.1 b)的解释； b) PCR 扩增反应中 Taq 酶过量，应确保每一步骤严格按照标准操作规程进行； c) 杂交试剂和 Luminex 仪器的问题，用确认的 DNA 样本对检测试剂和 Luminex 仪器进行验证； d) 杂交过程中未充分混匀、孵育时间过长、荧光染料过量、洗板后孔内上清残留过多，应确保每一步骤严格按照标准操作规程进行。 7.2.5 检测方法的局限性 基于已知序列信息的分型方法可能检测不到新的等位基因，或者无法与已知等位基因相区别，为避免漏检新的等位基因，当使用PCR-SSO方法时,可以加大探针的种类和数量，以提高检测到潜在的新的等位基因的可能性。 7.3 基于直接测序法（sequence-based
typing, SBT） 7.3.1 基本原理 基于SBT的HLA基因分型检测是对DNA序列进行直接测序，通过与国际HLA数据库比对分析，获得HLA等位基因型别的分析方法。任何DNA直接序列测定的方法均可用于HLA基因分型检测，该方法是最可靠的HLA基因分型方法，可准确确定新的HLA等位基因。 7.3.2 必需的设备（包括但不限于） PCR仪、DNA测序仪、HLA基因分型软件、计算机系统。 7.3.3 PCR 扩增引物及测序引物的设计 7.3.3.1 PCR 扩增引物一般针对 HLA Ⅰ类基因和 HLA Ⅱ类基因的各外显子进行扩增，宜使用商业试剂盒。 7.3.3.2 测序引物一般根据扩增产物的区域决定，可使用商业试剂盒。 7.3.3.3 引物和测序试剂应分装保存。 7.3.4 结果分析及问题的解决方法 7.3.4.1 总述 以Sanger双脱氧链终止法为代表的第一代测序方法应用较为广泛，本条内容主要针对采用第一代测序技术的HLA基因分型检测方法进行说明和要求。 7.3.4.2 常见问题可能原因及解决方法 7.3.4.2.1 无序列峰图信号 a) 测序模板未能有效扩增，应对扩增产物进行电泳分析，确定是否有足量特异性扩增产物，如扩增产物存在问题，应重新扩增； b) 测序引物选择存在问题，应核对加入引物的种类及加入量是否正确； c) 测序试剂配制、保存存在问题，每一步骤应严格按照标准操作规程进行。 7.3.4.2.2 测序背景信号高 a) 测序模板加入量没有达到要求，应重新调整测序模板加入量； b) 测序模板纯度（扩增条带特异性差或 PCR 抑制剂过多）没有达到要求，应重新纯化和扩增测序模板。 7.3.4.2.3 杂峰信号过多 a) 测序模板或测序 PCR 反应液污染，应重新进行扩增检测； b) 测序模板加入量偏少，测序信号值偏低，应调整测序模板加入量； c) 测序引物特异性或延伸效率较差，应重新设计或合成测序引物； d) 存在碱基插入或缺失区段，应进行等位基因特异性扩增测序或克隆测序鉴定； e) GC 含量过高，测序扩增反应效率过低，应调整测序 PCR 程序或调整测序反应体系。 7.3.5 检测方法的局限性 由于HLA具有高度多态性，在分型时测序区域有时会出现序列组合形式上完全相同的情况，这种情况既可能是由于两个或多个等位基因在所检测区域序列一致（两者差异在所检测区域之外），又可能是由于该测序区域存在相同的等位基因组合，此时应扩大检测区域或采用等位基因选择性扩增的方法进行分型。 8 质量控制 8.1 原则和目的 检测结果的准确性和可靠性依赖于实验室质量控制，质量控制包括对试剂、人员技能和设备仪器性能的质量控制。试剂包括检测用的任何化学或生物制品，对试剂的正确标记、保存、配制和使用都非常重要，试剂使用不当可能会影响检测结果的可靠性甚至对检测人员的健康和安全构成威胁。对人员的培训、仪器的校准、维护维修也是质量控制的组成部分。实验室开展的检测项目应至少参加一项能力验证/室间质量评价（Proficiency Testing/External Quality
Assessment, PT/EQA）项目，如果没有PT/EQA组织机构能够提供对该项目的室间质量评价，实验室应与其它实验室建立平行检测比较，至少每6个月一次。
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