（二）实验室检测。 1.实时荧光RT-PCR方法检测新冠病毒核酸。 （1）核酸检测实验室。 新冠核酸检测实验室按功能区布置位置的不同，可分为集中布置形式和分散布置形式。开展新冠病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增和产物分析区。根据所采用仪器的实际情况，标本制备区、扩增和产物分析区可进行合并。
集中布置形式的实验室设置应遵循“各区独立，单向流动（注 意风向，压力梯度走向），因地制宜，方便工作”的原则。各区的功能如下： ①试剂储存和准备区：用于分装、储存试剂、制备扩增反应混合液，以及储存和准备实验耗材。该区应配备冰箱或 冰柜、离心机、试验台、涡旋振荡器、微量加样器等。为防止污染，该区宜保持正压状态。 ②标本制备区：标本转运桶的开启、标本灭活（必要时）、 核酸提取及模板加入至扩增反应管等。该区应配备冰箱或冰 柜、生物安全柜、离心机、试验台、微量加样器，可根据实
际工作需要选配自动化核酸提取仪等。标本转运桶的开启、分装应在生物安全柜内完成。为防止污染，该区宜保持负压状态。为操作方便，标本的分装以及核酸提取也可以在独立的生物安全二级（BSL-2）实验室进行，提取的核酸可以转 运至该区加至扩增反应液中。 ③核酸扩增和产物分析区：进行核酸扩增反应和产物分 析。该区应配备实时荧光定量PCR仪。为防止扩增产物污染 环境，该区宜保持负压状态，压力等于或低于标本制备区。 （2）新冠病毒核酸的荧光定量RT-PCR检测。 实验室应当制定标准操作程序（SOP），并严格按照SOP进行操作。接到标本后，应当在生物安全柜内对标本进行清 点核对，并依据SOP进行试剂准备、标本前处理、核酸提取、
核酸扩增、结果分析及报告。实验室应当建立可疑标本复检的流程。 ①试剂准备。应当选择国家药品监督管理部门批准的试 剂，建议选择磁珠法、膜吸附法等进行核酸提取，建议根据
核酸提取试剂及扩增体系的要求选择配套的标本采样管，不 建议免提取核酸直接进行核酸扩增反应。 ②标本处理。使用含胍盐等灭活型采样液的标本无需进 行灭活处理，可直接进行核酸提取，而使用非灭活型采样液
的标本，按照核酸提取试剂盒的说明，取适量标本加至核酸提取裂解液中充分混匀作用一定的时间则可以有效灭活毒。不推荐采用56℃孵育30分钟的处理方式灭活病毒，该条 件不能保障充分灭活病毒。 污水样本处理可参考《农贸（集贸）市场新型冠状病毒 环境监测技术规范》（WS/T776—2021）推荐的方法。 ③核酸提取。将灭活后的标本取出，在生物安全柜内打 开标本采集管加样。或按照核酸提取试剂盒的说明，将标本与裂解液作用足够时间后继续核酸提取步骤，核酸提取完成后立即封盖。取适量核酸加至PCR 扩增反应体系中。 ④核酸扩增。将扩增体系放入荧光定量PCR仪，按照试 剂盒说明书设置扩增程序，启动扩增程序。扩增完成后反应管不可开盖，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高压，按一般医疗废物转移出实验室处理。 本指南中的核酸检测方法主要针对新冠病毒基因组中 开放读码框1ab（open
reading frame 1ab，ORF1ab）和核 壳蛋白（nucleocapsid protein，N）。 靶标一（ORF1ab）: 正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA 荧光探针（P）：
5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3' 靶标二（N）: 正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 荧光探针（P）：
5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3' ⑤结果判断。 阴性: 无Ct值、无S形扩增曲线。 阳性：Ct值小于等于检出限，且有S形扩增曲线，可报 告为阳性。 灰区：Ct值位于灰区，建议重复实验，若重做Ct值仍处 于灰区，但出现明显的S形扩增曲线，该样本判断为阳性， 否则为阴性。 注：如使用商品化试剂盒，则以厂家提供的说明书为准。 ⑥病例确认。 实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个： 条件一：同一份标本中新冠病毒2个靶标（ORF1ab、N） 实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性 的检测结果，则需要重新采样，重新检测。 条件二：两种标本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳 性，或同种类型标本2次采样检测中均出现单个靶标阳性的 检测结果，可判定为阳性。 环境与生物材料核酸检测阳性要排除疫苗接种物残留 污染的影响。核酸检测结果假阴性的可能原因包括：样本质量差；样本采集时间过早或过晚；样本保存、运输和处理不
当；其他原因如病毒变异、PCR抑制等。 ⑦质控。由上级疾控部门对下级疾控实验室进行核酸检测质控 考核，中国疾控中心每年至少开展一次对省级疾控机构实验室的质控考核，并同时提供全国新冠病毒实验室检测质控方案，省级针对地市级实验室的质控考核每年不少于2次。各检测机构应当加强核酸检测质量控制，选用扩增检测试剂盒指定的核酸提取试剂和扩增仪。 性能验证。临床标本检测前，实验室应对核酸提取试剂、 提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成的检测系统进行必要的性 能验证，性能指标包括但不限于精密度（至少要有重复性）和最低检测限。建议选用高灵敏的试剂（检测限≤500拷贝 /ml）。 室内质控。实验室可按照《国家卫生健康委办公厅关于 医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》（国 卫办医函〔2020〕53号）要求规范开展室内质控。每批检测至少有1 份弱阳性质控品（第三方质控品，通常为检出限的 1.5-3 倍）、3 份阴性质控品（生理盐水）。质控品随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。大规模人群筛查时，一旦出现阳性结果，应对阳性标本采用另外一到两种更
为灵敏的核酸检测试剂对原始标本进行复核检测，复核阳性方可报出。 物品和环境样本的采集检测，还需在采样前及采样过程 中至少设一个现场空白样本及一个运输空白样本，以进行过 程中的质量控制。 室间质评。实验室应常态化参加国家级或省级疾控机构 组织的室间质评。对检测量大以及承担重点人群筛查等任务的实验室，可适当增加室间质评频率。不按要求参加室间质评的，或室间质评结果不合格的，应通报批评并上报国家卫
健委，待室间质评通过后方可开展核酸检测。 2.病毒全基因组测序。 （1）测序标本选取原则。结合流调信息和病例传播链关系，优先选择以下标本开展测序：本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例、境外输入病例、入境物品及相关环境阳性标本、疫苗接种后核酸检测阳性者标本等。测序结果应与本
地近一个月的输入病例和本土病例序列进行比对。 （2）测序要求。以省为单位确定开展新冠病毒全基因 组测序的单位，包括省、市级疾控机构和科研机构。各省要建立本省输入、本土病例新冠病毒基因组数据库，应具备序列对比分析能力。建议首选膜吸附法（人工）提取核酸，以二代测序技术进行新冠全基因组测序。具备测序条件的省份
要在接收标本24小时内开展测序工作，关键样本要求收到样本后一周内提供测序结果报告，并在获得测序结果后4小时 内将基因序列原始数据(一般为fastq格式) 和测序样本送 检单（见附件10-2）报送中国疾控中心。不具备测序条件的
省份要在病例报告后48小时内将病例标本送达中国疾控中 心，中国疾控中心在获得序列信息后24小时内向送样单位反 馈分析结果，并报国家卫生健康委。 （3）上送标本要求。如标本需上送至中国疾控中心进行测序，应同时平行采集2次，混入1管中，然后平均分装成 2份，一份由各省（市）及时开展病毒全基因组测序，另一份应在24小时内启动送样程序，上送中国疾控中心。如果需要中国疾控中心进行病毒分离，应确保病毒采样液中不含有 灭活剂成分。 3.血清抗体检测。 血清抗体检测（胶体金、磁微粒化学发光、ELISA）用作新冠病毒核酸检测阴性病例的补充检测，在疑似病例诊断中与核酸检测协同使用。建议采集急性期（发病7天内）和恢复期（3-4周后）双份血清进行检测，也可根据临床需要 确定采集时间。抗体检测阳性者应排除新冠疫苗接种因素的影响。 三、实验室活动生物安全要求 根据新冠病毒传播特性、致病性和临床资料等信息，该 病毒按照第二类病原微生物进行管理，具体要求如下： （一）实验活动规范。新冠病毒培养、动物感染实验应 当在生物安全三级及以上实验室开展；未经培养的感染性材 料的操作应当在生物安全二级及以上实验室进行，同时采用 不低于生物安全三级实验室的个人防护；灭活材料的操作应
当在生物安全二级及以上实验室进行；不涉及感染性材料的 操作，可以在生物安全一级实验室进行。 （二）相关样本处置。各省级卫生健康行政部门要根据 疫情防控需要和实验室生物安全有关要求，及时研判提出新冠病毒实验室检测生物样本处置意见。对确需保存的，应当 尽快指定具备保存条件的机构按照相对集中原则进行保存，或送至国家级菌（毒）种保藏中心保藏；对无需保存的，由
相关机构按照生物安全有关要求及时处理。 （三）实验室废弃物处理及实验室污染的处理。参考《医 疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册》（试行第二版）。 附件：10-1.新冠病毒检测标本送检表 10-2.新冠病毒环境标本送检表
10-3.新冠病毒标本序列测定结果 |
