4.3
其他试剂和材料 4.3.1 磷酸盐缓冲液(见附录 A.6)。 4.3.2 标准硬水(见附录 A.7)。 4.3.3 有机干扰物：采用 3%牛血清白蛋白；如为清洁物品采用 0.3%牛血清白蛋白。 4.3.4 载体：304 不锈钢圆筒，表面抛光，外径 8 mm±1 mm，内径 6 mm±1 mm，壁厚 1 mm±0.5 mm，长度 10 mm±1 mm。 4.3.5 吊钩：长度为 50 mm～75 mm，直径为 0.5 mm 的镍铬合金丝，末端 3 mm 呈直角弯曲。 4.3.6 滤纸：直径为 90 mm 的定性滤纸。 4.3.7 器皿：25 mm×100 mm 玻璃试管，直径为 90 mm 的平皿，10 mL 吸管，移液器等。 4.4
仪器设备 Ⅱ级及以上生物安全柜、恒温培养箱、振荡培养箱、恒温水浴箱、计时器等。 5
染菌载体的制备 5.1
载体准备 5.1.1
外观检查 载体经肉眼观察合格，方可使用。如有可见破损如钝化、缺口、凹陷或凿孔等应剔除。 5.1.2
清洗 将载体置于1 mol/L NaOH溶液中浸泡约12 h，用去离子水反复冲洗3次～4次，收集冲洗水加入2滴～3滴1%酚酞溶液，如酚酞变为粉红色，表明有NaOH残留，需要继续冲洗至酚酞不变色，将载体晾干后密闭保存。 5.1.3
筛选测试 5.1.3.1 测试要求 未使用过或使用过但试验中无菌生长的载体，不需进行筛选测试，经压力蒸汽灭菌后可使用。使用过的载体且在试验中有菌生长，应进行筛选测试，测试合格方可使用。 5.1.3.2 测试方法 按照7.1规定，在无有机干扰物条件下，选用500 mg/L苯扎氯铵消毒液对铜绿假单胞菌消毒作用10min，以Letheen肉汤作为中和剂培养液，对每个载体进行杀菌试验。 5.1.3.3 测试结果判断 无菌生长为载体筛选测试合格，测试管中有菌生长，则该载体不合格。 5.1.4
灭菌 载体染菌前，将清洗后的载体放入试管中，加入去离子水至载体完全浸没，经压力蒸汽灭菌后，冷却至室温备用。 5.2
菌悬液的制备 5.2.1 参照 WS/T 683 的规定复苏菌种，接种于含 10 mL 营养肉汤或合成肉汤的试管中，经 36 ℃±1 ℃，200 r/min±20 r/min 振荡培养 24 h±2 h，此为第 1 代培养物。 5.2.2 用移液器取第 1 代培养物 10 μL 转种于含 10 mL 营养肉汤或合成肉汤的试管中，经 36 ℃±1 ℃，200 r/min±20 r/min 振荡培养 24 h±2 h，此为第 2 代培养物，可继续传代培养至第 5 代。 5.2.3 用移液器取第 1～5 代的 24 h 新鲜培养物 10 μL 转种于 10 个含 10 mL 营养肉汤或合成肉汤的试管中，经 36 ℃±1 ℃静置培养 48 h～56 h 后备用。 5.2.4 铜绿假单胞菌培养物应去除培养菌液表面的菌膜，或使用 10mL 吸管直接从溶液中部吸取菌液，放入另一个试管中。不可使用含菌膜的菌悬液进行试验。 5.2.5 将金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌和去除菌膜的铜绿假单胞菌培养菌液用电动混匀器振荡混合20s，室温静置 10 min 后，用 10 mL 吸管吸取上层四分之三的菌液转移至新的试管中混匀，以去除细菌碎片和团块，菌悬液于 4 ℃冷藏保存备用，于 30 min 内使用。 5.2.6 根据消毒剂的检测要求，按照 WS/T 683 的规定加入有机干扰物。 5.3
载体染菌 5.3.1 每次试验时取 80 个无菌载体染菌，首先向 4 个无菌试管（25 mm×100 mm）中分别加入 20 mL制备好的菌悬液，依次向每管菌液中加入 20 个干燥无菌载体，确保载体完全浸没于菌液中，持续 15 min±2 min。 5.3.2 用灭菌后的吊钩取出载体，轻触管壁去除多余菌液，垂直放置于无菌的双层滤纸上，置 36 ℃±1 ℃恒温培养箱内干燥 40 min±2 min 后，于 2 h 内进行试验。 5.4
染菌载体菌落计数 5.4.1 随机挑选 2 个染菌载体，分别放入 2 个含 10 mL 营养肉汤的 50 mL 离心管中，用电动混匀器剧烈振荡混匀 20 s 进行洗脱，使用磷酸盐缓冲溶液进行 10 倍系列稀释。 5.4.2 选择适宜的稀释度,吸取 1 mL 加入无菌平皿中，将冷却至 40 ℃～45 ℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于平皿中，平行接种于 2 个平皿，置 36 ℃±1 ℃恒温培养箱中培养 48 h±2 h 后进行菌落计数。 5.4.3 每个染菌载体上金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的回收菌量为 1.0×106 CFU/载体～1.0×107 CFU/载体，肠炎沙门菌的回收菌量为 1.0×105 CFU/载体～1.0×106 CFU/载体。 6
中和剂鉴定试验 6.1
试验原则 通过中和剂鉴定试验结果，判断所选中和方法对消毒剂是否有效中和。若中和Ⅰ组显示可有效中和，则仅使用中和剂培养液进行中和。若中和Ⅰ组结果显示未完全中和，而中和Ⅱ组为有效中和，则在选用中和剂培养液进行中和的基础上，再使用培养液进行二次中和。如仍显示未完全中和，则继续进行中和Ⅱ组试验。试验重复三次。 6.2
菌悬液的稀释 6.2.1 取 1 mL 制备好的菌悬液加入 9 mL 磷酸盐缓冲溶液中进行 10 倍梯度稀释，取 4 个稀释梯度（举例：10-4、10-5、10-6和
10-7）进行中和试验。 6.2.2 同时取 4 个稀释梯度各 1.0 mL 采用倾注法接种于 TSA 平板中，置36℃±1 ℃恒温培养箱中培养48 h±2 h 后，进行菌落计数。
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