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病毒灭活 将样本充分混匀后置于60 ℃水浴30 min。 注：水浴锅水位应高于样本液面，确保容器内样本达到目标温度。 7
病毒富集浓缩 注：本部分中三种新型冠状病毒富集浓缩方法适用条件相同，使用过程中可根据实验条件进行选择。 7.1
聚乙二醇沉淀法 7.1.1
原理 向污水中加入聚乙二醇，聚乙二醇在一定盐浓度条件下可使病毒颗粒形成多聚体，在一定离心力下将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，用于后续核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。 7.1.2
试剂和材料 7.1.2.1
试剂 7.1.2.1.1 聚乙二醇：分子生物学级，平均分子量 8 000。 7.1.2.1.2 氯化钠：分子生物学级。 7.1.2.1.3 无核酸酶水：分子生物学级。 7.1.2.2
材料 7.1.2.2.1 无菌带盖离心管：1.5 mL，无核酸酶；50 mL 或 250 mL，可承受离心力≥12 000 g。 7.1.2.2.2 无菌移液器吸头：1 mL，带滤芯，无核酸酶。 7.1.2.2.3 无菌移液管：50 mL。 7.1.3
仪器设备 7.1.3.1 高速冷冻离心机：4 ℃，50 mL 或 250 mL 转子，可承受离心力≥12 000 g。 7.1.3.2 电子天平：分辨力不低于 0.001 g。 7.1.3.3 生物安全柜：II 级或 II 级以上。 7.1.3.4 高压灭菌器。 7.1.3.5 移液器：1 mL。 7.1.3.6 大容量电动移液器。 7.1.4
富集浓缩步骤 7.1.4.1
预离心 用大容量电动移液器分别移取3份35 mL污水样本置于3个50 mL离心管中，在4 ℃、2 500 g条件下离心30 min，将上清液分别转移到另外3个50 mL离心管中备用。剩余污水样本作为备份。 注1：当污水样本悬浮物含量过高，可能影响病毒核酸提取和实时荧光RT-PCR检测时，应采用预离心弃除悬浮物后再进行后续操作。 注2：若选用250 mL离心管，可直接取105 mL污水样本于250 mL离心管中，在上述条件下离心后将上清液转移到另外1个250 mL离心管中备用。 7.1.4.2
第二次离心 在3个装有35 mL污水样本或预离心后上清液的50 mL离心管中分别加入3.5 g±0.1 g聚乙二醇和0.79 g±0.01 g氯化钠，充分混合，直至试剂完全溶解，该溶解过程约需15 min。然后在4 ℃、12 000 g条件下离心120 min，离心机降速时不应使用制动力。离心机停止后倾倒并弃除离心管中的上清液，至无上清液流出。 注：若选用250 mL离心管，在装有105 mL污水样本或预离心后上清液的250 mL离心管中操作时，聚乙二醇和氯化钠用量应等比例增加，其他操作相同。 7.1.4.3
富集浓缩 7.1.4.3.1 在 4 ℃、12 000 g 条件下将第二次离心后剩余的样本再次离心 5 min，离心机降速时不应使用制动力。离心机停止后用移液器从离心管中吸出并弃除剩余的上清液。 7.1.4.3.2 吸取 0.4 mL 无核酸酶水加入到其中的一个离心管中，反复吹吸沉淀，瞬时离心，使所有液体聚集在管底，将混悬液吸出并加入到第二个离心管中。 7.1.4.3.3 重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作后，再次将混悬液吸出并加入到第三个离心管中。 7.1.4.3.4 继续重复吹吸沉淀和瞬时离心的操作，最终形成的混悬液即为该水样的浓缩液，体积约为0.6 mL。将浓缩液转移至 1.5 mL 离心管中，于 0 ℃～4 ℃条件下保存，并于 24 h 内完成核酸提取和实时荧光 RT-PCR 检测。 注：若选用250 mL离心管，按照7.1.4.3.1条件再次离心并弃除剩余的上清液后，在离心管中加入0.4 mL无核酸酶水，反复吹吸沉淀，并瞬时离心后即得到浓缩液。 7.2铝盐混凝沉淀法 7.2.1
原理 向污水中加入铝盐混凝剂，铝盐水解产生的氢氧化铝胶体可吸附和包裹病毒颗粒，通过离心作用收集含病毒的胶体，然后通过化学溶解释放出包裹的病毒颗粒，用于后续核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。 7.2.2
试剂和材料 7.2.2.1
试剂 7.2.2.1.1 实验用水：GB/T 6682 规定的一级水。 7.2.2.1.2 氯化铝溶液[c（AlCl3）=0.3 mol/L]：称取 4 g 无水氯化铝（纯度≥99 %），置于烧杯中，加入 100 mL 水，搅拌溶解后转移至试剂瓶中。 7.2.2.1.3 氢氧化钠溶液[c（NaOH）=1 mol/L]：称取 4 g 氢氧化钠（纯度≥96 %），置于烧杯中，加入100 mL 水，搅拌溶解后转移至试剂瓶中。 7.2.2.1.4 盐酸溶液[c（HCl）=1 mol/L]：移取 43 mL 盐酸（分析纯，ρ20=1.19 g/mL）于烧杯中，加入适量水，用玻璃棒搅拌混匀后转移至 500 mL 容量瓶中，并定容至刻度。 7.2.2.1.5 乙二胺四乙酸二钠二水合物（C10H14N2O8Na2·2H2O）：纯度≥98 %。 7.2.2.2
材料 7.2.2.2.1 无菌螺口锥形瓶：100 mL。 7.2.2.2.2 无菌带盖离心管：10 mL、50 mL。 7.2.2.2.3 无菌移液器吸头：200 μL、1 mL，带滤芯，无核酸酶。 7.2.2.2.4 无菌移液管：50 mL。
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