7.2.3
仪器设备 7.2.3.1 冷冻离心机：4 ℃，50 mL 转子，可承受离心力≥2 500 g。 7.2.3.2 恒温振荡培养箱。 7.2.3.3 电子天平：分辨力不低于 0.001 g。 7.2.3.4 pH 计：精度≥0.01。 7.2.3.5 水浴锅。 7.2.3.6 生物安全柜：II 级或 II 级以上。 7.2.3.7 高压灭菌器。 7.2.3.8 移液器：200 μL、1 mL。 7.2.3.9 大容量电动移液器。 7.2.4
富集浓缩步骤 7.2.4.1
预离心 取大于50 mL的污水样本在4 ℃、2 500 g条件下离心30 min，留取上清液备用。剩余污水样本作为备份。 注：当污水样本悬浮物含量过高，可能影响病毒核酸提取和实时荧光RT-PCR检测时，应采用预离心弃除悬浮物后再进行后续操作。 7.2.4.2
富集浓缩 7.2.4.2.1
絮凝处理 用大容量电动移液器将50 mL污水样本或预离心后的上清液转移至100 mL螺口锥形瓶中，加入0.5 mL 0.3 mol/L的氯化铝溶液，用1 mol/L氢氧化钠溶液或1 mol/L盐酸溶液调节水样pH=6.0±0.1。将螺口锥形瓶盖拧紧，置于恒温振荡培养箱中，以150 r/min的速度在室温下混合15 min。 7.2.4.2.2
离心分离 将水样转移至50 mL离心管中，在4 ℃、1 900 g条件下离心5 min。 7.2.4.2.3
络合溶解 倾倒弃除离心管中的上清液，在剩余胶体中加入0.20 g±0.01 g乙二胺四乙酸二钠二水合物，摇晃数十次至胶体变为液态，转移至10 mL离心管中。将10 mL离心管置于水浴锅中，60 ℃水浴10 min。水浴后离心管中的液体即为该水样的浓缩液，体积约为1 mL，于0 ℃～4 ℃条件下保存，并于24 h内完成核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。 7.3离心超滤法 7.3.1
原理 选用嵌有超滤膜的超滤杯，通过离心作用将分子量大于超滤膜截留分子量的病毒颗粒截留在超滤杯内，收集超滤杯中的病毒浓缩液，用于后续核酸提取和实时荧光RT-PCR检测。 7.3.2
材料 7.3.2.1 一次性超滤杯：截留分子量为 30 kDa，体积为 70 mL，可倒置离心回收样本。 7.3.2.2 无菌带盖离心管：2 mL，无核酸酶；50 mL。 7.3.2.3 无菌移液器吸头：1 mL，带滤芯，无核酸酶。 7.3.2.4 无菌移液管：50 mL。 7.3.3
仪器和设备 7.3.3.1 冷冻离心机：4 ℃，50 mL 转子，可承受离心力≥6 000 g。 7.3.3.2 冷冻离心机：4 ℃，250 mL 水平转子，可承受离心力≥3 000 g。 7.3.3.3 生物安全柜：II 级或 II 级以上。 7.3.3.4 高压灭菌器。 7.3.3.5 移液器：1 mL。 7.3.3.6 大容量电动移液器。 7.3.4
富集浓缩步骤 7.3.4.1
预离心 7.3.4.1.1 用大容量电动移液器移取 50 mL 污水样本于 50 mL 离心管中，在 4 ℃、5 000 g 条件下离心30 min，分别保留上清液和沉淀物。剩余污水样本作为备份。 7.3.4.1.2 取 0.5 mL 上清液加入到保留沉淀物的离心管中，将沉淀物重悬混匀，保留待用。 7.3.4.2
富集浓缩 7.3.4.2.1 超滤杯前处理：取 30 mL 无菌水加入到样品浓缩杯中，使用水平转子在 4 ℃、2 480 g 条件下离心 10 min，弃除滤液收集杯中的滤出液，再将样品浓缩杯反向倒置在浓缩液收集杯上，在 4 ℃、920 g 条件下离心 3 min，弃除收集液。 7.3.4.2.2 将 7.3.4.1.1 预离心得到的上清液转移至样品浓缩杯中，使用水平转子在 4 ℃、2 480 g 条件下离心 15 min。如样品浓缩杯中残留液体体积较大，可适当延长离心时间，直至浓缩杯中液体约为 0.3 mL～0.6 mL。 7.3.4.2.3 待全部上清液浓缩完成后，将样品浓缩杯反向倒置在浓缩液收集杯上，在 4 ℃、920 g 条件下离心 3 min，吸取浓缩液收集杯中的液体，转移至 2 mL 离心管中。 7.3.4.2.4 吸取 7.3.4.1.2 预离心得到的沉淀物混悬液 0.5 mL，与 7.3.4.2.3 中得到的液体混合，即为该水样的浓缩液，体积约为 0.8 mL～1.1 mL，于 0 ℃～4 ℃条件下保存，并于 24 h 内完成核酸提取和实时荧光 RT-PCR 检测。 注1：也可选用截留分子量为100 kDa的超滤杯，但对应离心浓缩时离心力不宜超过3 000 g； 注2：也可选用不带倒置离心功能的超滤杯，但在完成7.3.4.2.2后，7.3.4.2.3应改为“待全部上清液浓缩完成后，取下样品浓缩杯，用移液器吸取浓缩液体小心吹打膜数次后，吸取所有浓缩液并转移至2 mL离心管中”。 8
核酸检测 8.1核酸提取 8.1.1
试剂和材料 8.1.1.1
试剂 8.1.1.1.1 病毒核酸提取试剂盒。 8.1.1.1.2 无核酸酶水：分子生物学级。 8.1.1.2
材料 8.1.1.2.1 无菌带盖离心管：1.5 mL，无核酸酶。 8.1.1.2.2 无菌移液器吸头：10 μL、200 μL、1 mL，带滤芯，无核酸酶。 注：其他材料参照所用病毒核酸提取试剂盒。 8.1.2
仪器和设备 8.1.2.1 生物安全柜：II 级或 II 级以上。 8.1.2.2 高压灭菌器。 8.1.2.3 移液器：10 μL、200 μL、1 mL。 注：其他仪器和设备参照所用病毒核酸提取试剂盒。 8.1.3
核酸提取步骤 在生物安全柜中打开装有污水样本浓缩液的离心管，按照病毒核酸提取试剂盒说明，取适量浓缩液进行核酸提取，提取完成后应立即封盖并马上进行实时荧光RT-PCR检测。剩余的浓缩液和核酸样本应于-80 ℃条件下冻存。 8.2实时荧光
RT-PCR 检测 8.2.1
试剂和材料 8.2.1.1
试剂 8.2.1.1.1 新型冠状病毒核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）。 8.2.1.1.2 无核酸酶水：分子生物学级。 8.2.1.2
材料 8.2.1.2.1 无菌移液器吸头：10 μL、100 μL、200 μL、1 mL，带滤芯，无核酸酶。 8.2.1.2.2 无菌 PCR 管或 PCR 板：无核酸酶。 8.2.2
仪器和设备 8.2.2.1 实时荧光 PCR 仪。 8.2.2.2 混匀器。 8.2.2.3 生物安全柜：II 级或 II 级以上。 8.2.2.4 移液器：10 μL、100 μL、200 μL、1 mL。 注：其他仪器和设备参照所用新型冠状病毒核酸检测试剂盒。
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