四、实验室管理基本要求 (一-) 实验室资质要求 开展猴痘病毒核酸检测的实验室，应当符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》(国务院令第 424号)和《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》(卫办医政发(2010) 194号)有关规定，具备国家卫生健康委备案的生物安全三级(BSL-3)实验室及以上实验室条件，并获得从事猴痘病毒实验活动的批准，具备临床基因扩增检验实验室条件。独立设置的医学检验实验室还应当符合《医学检验实验室基本标准(试行)》《医学检验实验室管理规范(试行)》等要求。 (二)实验室生物安全要求 根据《人间传染的病原微生物名录》中的有关规定,猴痘病毒生物危害分类为第一类，是一种高致病性病毒。涉及活病毒的样本灭活操作需在BSL-3及以上实验室的生物安全柜内进行。灭活样本中的病毒DNA提取可在生物安全二级(BSL -2)实验室或PCR检测的专门区域或房间进行，严格按照分区操作原则操作。 (三)实验室分区要求 原则上开展猴痘病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域:试剂储存和准备区、标本制备区、扩增和产物分析区。三个区域在物理空间上应完全相互独立，不能有直接空气流通。各区功能分别是: 1.试剂储存和准备区:贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的制备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。 2.标本制备区:转运桶开启、标本灭活，核酸提取及加入至扩增反应管等。 3.扩增和产物分析区:核酸扩增和产物分析。 根据使用仪器的功能，区域可适当合并。如采用标本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，标本制备区、扩增和产物分析区可合并。 (四)主要仪器设备 实验室应当配备与开展检验项目相适宜的仪器设备，包括:二级生物安全柜、高速台式离心机、干浴恒温器、荧光定量PCR仪、计时器、组织匀浆仪、移液器(100μL, 200μL, 1000μL) 。 五、实验室猴痘病毒核酸检测 实验室接到标本后，应当在BSL-3及以上实验室的生物安全柜内对标本进行清点核对，并对标本进行灭活处理。按照标准操作程序进行试剂准备、标本前处理、核酸提取、核酸扩增、结果分析及报告。实验室应当建立可疑标本和阳性标本复检流程。 (一)试剂与材料 1.标本:包括痘疱液、病变皮疹、痘痂、全血或血清、咽拭子、皮疹和痘疱表面或渗出液拭子和其它可疑标本。 2.核酸提取试剂盒(基因组DNA提取试剂盒) :组织基因组DNA提取试剂盒或血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。 3.核酸检测试剂: (1)试剂: DNA聚合酶或预混的PCR反应试剂(PCR Master Mix)。
(2)猴痘病毒检测引物、探针:
(3)阳性对照: 涵盖检测部位序列的质粒。 4.灭菌去离子水、无水乙醇 5.消毒液 (1) 75%医用酒精:用于手部和物体表面常规消毒，整瓶开启有效期1周。 (2)含氯消毒液:每次现用现配，含有效氯1000mg/L的消毒液用于手部和物体表面常规消毒,含有效氯5000mg/L的消毒液用于感染性材料溢酒时的应急处理。 6.耗材:包括带滤芯的吸头、螺旋口的离心管、非螺旋口的离心管、含锆珠的粉碎管、PCR反应板和透明封膜或PCR反应管和透明盖。 7. BSL-3个人防护用品:包括医用防护口罩、医用连体防护服、防护眼罩、一次性帽子、鞋套、靴套和手套。 8. BSL-2或PCR室个人防护用品:包括反穿衣、一次性手套、口罩、帽子、鞋套(或工作鞋)。 (二)实验前的样品接收 1.核对被检样本编号、姓名、性别、年龄及检测项目; 2.待检样本的状态如有异常，需注明; 3.待检样本长期存放在-70C，短期存放可在-20C，避免反复冻融。 (三)核酸检测操作步骤及注意事项 1.病毒核酸(DNA) 的制备 需注意:未灭活样本必须在BSL-3及以上实验室的生物安全柜内进行，至病毒灭活后方可从实验室中取出进行下一步操作。操作方法按DNA提取试剂盒相应说明书进行操作，具体如下: (1)提取试剂准备:第一次开启试剂盒，在使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上标签。所有试剂在使用前应平衡至室温;所有离心步骤应在室温下进行。 (2)处理样本: A.痘疱液:将痘疱液用适当体积的含PS的PBS或DMEM重悬，取100μL样本，加入80μL缓冲液,总量为180μL;样本不足100 μL时用缓冲液补足至总量180μL; B.病变皮疹或痘痂:取1块痂皮按质量/体积(1mg:5μL)加入相应体积含PS的PBS，研磨或匀浆处理，取80μL,然后加入100μL缓冲液; C.咽拭子、其它拭子:若拭子在样本保存液中可直接取200μL样本，若为干拭子可用3ml含PS的PBS或DMEM重悬，然后取200μL样本; D.全血或血清:直接取200μL样本。 (3)加入20 μL蛋白酶K溶液，混匀，溶液会变清亮。若样本为病变皮疹或其它组织时，加入蛋白酶K混匀后，在56°C放置，直至组织溶解，再进行下一步骤。 (4)加200 μL裂解缓冲液，充分混匀，70C放置10 min,或至溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。 需注意:加入裂解缓冲液后可能会出现白色絮状沉淀，在70°C放置后会消失。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少或提取出的DNA不纯。 (5)加200 uL无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁水珠。 通过以上操作，病毒灭活。若需要从BSL-3及以上实验室取出继续其它操作，可将样本管表面用含有效氯1000mg/L 的消毒液擦拭，从生物安全柜中取出，放入样本盒中。对样本管表面及样本盒(内外)完全消毒后带出BSL-3实验室。
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