③核酸提取。将灭活后的标本取出，在生物安全柜内打开标本采集管加样，或按照核酸提取试剂盒的说明，将标本与裂解液作用足够时间后继续核酸提取步骤，核酸提取完成后立即封盖。取适量核酸加至 PCR 扩增反应体系中。 ④核酸扩增。将扩增体系放入荧光定量 PCR 仪，按照试剂盒说明书设置扩增程序，启动扩增程序。扩增完成后反应管不可开盖，直接放于垃圾袋中，封好袋口，不可高压，按一般医疗废物转移出实验室处理。 检测机构所选用的新冠病毒核酸检测试剂应针对新冠病毒基因组中开放读码框 1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）基因，人体标本检测原则上选择含内源性内参的核酸检测试剂。 ⑤阳性标本的确认。实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个： 条件一：同一份标本中新冠病毒 2 个靶标（ORF1ab、N）实时荧光 RT-PCR
检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新检测或重新采样复核。 条件二：两种标本实时荧光 RT-PCR 同时出现单靶标阳性，或同种类型标本两次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。 环境与生物材料核酸检测阳性要排除疫苗接种物残留污染的影响。核酸检测结果假阴性的可能原因包括：标本质量差；标本采集时间过早或过晚；标本保存、运输和处理不当；其他原因如病毒变异、PCR 抑制等。 ⑥质控。由上级疾控部门对下级疾控实验室进行核酸检测质控考核，中国疾控中心每年至少开展一次对省级疾控机构实验室的质控考核，并同时提供全国新冠病毒实验室检测质控方案，省级针对地市级实验室的质控考核每年不少于两次。各检测机构应当加强核酸检测质量控制，选用扩增检测试剂盒指定的核酸提取试剂和扩增仪。 性能验证。临床标本检测前，实验室应对核酸提取试剂、提取仪、扩增试剂、扩增仪等组成的检测系统进行必要的性能验证，性能指标包括但不限于精密度（至少要有重复性）和最低检测限。 室内质控。实验室可按照《国家卫生健康委办公厅关于医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》（国卫办医函〔2020〕53 号）要求规范开展室内质控。每批检测至少有1 份弱阳性质控品（第三方质控品，通常为检出限的 1.5-3 倍）、3 份阴性质控品（生理盐水）。质控品随机放在临床标本中，参与从提取到扩增的全过程。大规模人群筛查时，一旦出现阳性结果，应对阳性标本采用另外一到两种更为灵敏的核酸检测试剂对原始标本进行复核检测，复核阳性方可报出。 物品和环境标本的采集检测，还需在采样前及采样过程中至少设一个现场空白标本及一个运输空白标本，以进行过程中的质量控制。 室间质评。实验室应常态化参加国家级或省级疾控机构组织的室间质评。对检测量大以及承担重点人群筛查等任务的实验室，可适当增加室间质评频率。不按要求参加室间质评的，或室间质评结果不合格的，应通报批评并上报国家卫健委，待室间质评通过后方可开展核酸检测。 核酸检测实验室质控详细内容参见《国家卫生健康委办公厅关于加强疾控机构新冠病毒核酸检测实验室质量控制的通知》（国卫办疾控函〔2021〕548 号）《疾控机构新冠病毒核酸检测质量控制方案》。 2.病毒全基因组测序。病毒全基因组测序可以监测病毒基因组突变，为新冠病毒核酸检测试剂、疫苗研发策略的改变提供实验数据，同时也为流调溯源工作提供支持。 （1）测序标本选取原则。结合流调信息和病例传播链关系，优先选择以下标本开展测序：核酸检测 Ct 值≤32 的本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例、境外输入病例、入境物品及相关环境阳性标本、疫苗接种后核酸检测阳性者标本等。测序结果应与本地近一个月的输入病例和本土病例序列进行比对。对同一传播链或流行病学关系明确的病例无需全部测序。 （2）测序要求。 ①测序单位和流程。以省、自治区、直辖市为单位确定开展新冠病毒全基因组测序的机构，包括省级疾控机构和科研机构；具备测序条件的省份要在接收标本后24小时内开展测序工作。不具备测序条件的省份要及时将标本送至病毒病所，病毒病所收到标本后及时启动序列测定工作。 ②结果报告与反馈。各省份要建立本省输入、本土病例新冠病毒基因组数据库，及时进行序列比对分析，逐步提高自主分析能力。获得的全部测序数据都必须上报中国疾控中心病毒病所用于我国新冠病毒溯源数据库的更新与维护。对本土疫情的指示或首发病例、本土疫情中由不同基因型的毒株导致的新传播链的指示或首发病例，测序完成后应于24小时内将数据报送病毒病所，病毒病所确认数据完整无误后于48小时之内反馈结果；对本土疫情中归属已知传播链的病例、境外输入病例、环境标本（非指示或首发病例相关），测序数据于每周周一上午集中上报，病毒病所确认数据完整无误后于一周之内反馈结果。 3.血清抗体检测。血清抗体检测用作新冠病毒核酸检测的补充检测，也用于评估疫苗接种后诱发的免疫反应。应采用中国药品监督管理局批准的试剂进行检测，采集急性期（发病 7天内）和恢复期（3-4 周后）双份血清进行检测，也可根据临床需要确定采集时间，疑似新冠病毒感染者抗体检测阳性时应排除新冠疫苗接种因素的影响。 4.病毒分离培养。 （1）病毒分离培养对象。对核酸检测 Ct 值≤30 的所有境外输入病例的标本、本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例以及疫苗接种后核酸阳性者标本开展病毒分离培养。 （2）毒株报送与结果反馈。具有新冠病毒分离、培养资质的省级疾控机构应开展病毒分离培养工作，收到关键标本后96小时内开展相关工作，在获得分离毒株后96小时内将毒株送病毒病所保存备案，并将毒株序列等相关信息报送病毒病所。不具备病毒分离条件的省份，要在病例报告后48小时内启动送样流程，将标本送达病毒病所，病毒病所收到标本后应在96小时内启动病毒分离工作，获得毒株后96小时内反馈分析结果。 5.抗原检测。不具备开展核酸检测条件的基层医疗卫生机构、隔离观察人员和有抗原自我检测需求的社区居民可以进行抗原检测。抗原检测不作为确诊病例或无症状感染者诊断的依据，仅用作核酸检测方法的补充，实现“快筛快检”，提高感染者发现的及时性。具体实施流程及要求参照《新冠病毒抗原检测应用方案（试行）》（联防联控机制综发﹝2022﹞21号）执行。 三、实验室活动生物安全要求 根据新冠病毒传播特性、致病性和临床资料等信息，该病毒按照第二类病原微生物进行管理，具体要求如下： （一）实验活动规范。 新冠病毒培养、动物感染实验应当在生物安全三级及以上实验室开展；未经培养的感染性材料的操作应当在生物安全二级及以上实验室进行，同时采用不低于生物安全三级实验室的个人防护；灭活材料的操作应当在生物安全二级及以上实验室进行；不涉及感染性材料的操作，可以在生物安全一级实验室进行。 （二）相关标本处置。 各省级卫生健康行政部门要根据疫情防控需要和实验室生物安全有关要求，及时研判提出新冠病毒实验室检测生物标本处置意见。对确需保存的，应当尽快指定具备保存条件的机构按照相对集中原则进行保存，或送至国家级菌（毒）种保藏中心保藏；对无需保存的，由相关机构按照生物安全有关要求及时处理。 （三）实验室废弃物处理及实验室污染的处理。 参考《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册》（试行第二版）。
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