四、风险评估和控制 溶瘤病毒产品类型较多，基因设计、生物学特性和作用机制情况复杂，使用到的生产/包装细胞类型多样，生产工艺和质量研究也各有不同，因此，对于不同类型的溶瘤病毒产品，可基于质量风险特征制定相应的控制措施。 溶瘤病毒产品质量相关风险一般包括以下方面： 1. 生产用物料方面 （1）对病毒传染性、致病性和毒力等研究和认识不足，缺乏相应的风险控制而引入的风险。 （2）病毒基因修饰和/或多次传代导致病毒发生基因突变的风险，以及病毒基因插入细胞基因组致癌的风险。 （3）对细胞基质认知不够充分、检定项目不全面以及肿瘤细胞、宿主细胞 DNA 和宿主蛋白质残留的风险。 （4）生产过程中添加的生产用原材料，尤其是动物/人源材料外源因子控制不全面的风险 （5）新型辅料人体使用安全性、免疫原性的风险。 2. 生产工艺方面 （1）生产工艺相关操作对病毒理化特性、生物学活性等产生不良影响的风险。 （2）生产过程中污染/交叉污染的风险。 3. 质量研究方面 （1）质量研究项目不全面引入的风险。 （2）分子变体、非完整包装病毒（如非包膜病毒颗粒、 空壳病毒颗粒等）、错误包装病毒颗粒、无活性病毒颗粒、病毒颗粒聚集体、生物学活性等分析方法受限或变异性较大引入的风险。 基于以上质量相关风险，应制定相应的风险控制策略。例如，针对生产用物料的风险应进行全面的研究和风险评估，对生产工艺进行充分研究和验证，结合不同病毒特点开展全面的质量研究和质量控制，并对质量控制方法进行全面验证，开展全面的稳定性研究和包装容器相容性研究，采用多种方式来降低环境和人员风险，如设定合理的废弃物处理手段，在适当的生物防护条件下进行产品的处理等。 五、生产用物料 本指导原则中生产用物料主要指用于生产溶瘤病毒产品的物质或材料，包括起始原材料（如病毒种子、生产/包装细胞），生产过程中使用或添加的原材料（如培养基及其添加成分、纯化试剂等）、辅料、以及生产用耗材（如培养袋、储液袋、移液管路、滤膜等）等。生产用物料直接关系到产品的安全性和有效性，需要建立良好、规范的质量管理体系，并参照《中国药典》等相关要求进行风险评估和质量控制。 1. 起始原材料 1.1 病毒种子 1.1.1 病毒选择的一般考虑 病毒选择一般应基于临床应用目的、安全性（病毒研究历史、流行病数据、分子结构、既往使用经验和体内安全性数据、病毒载体设计成熟程度和研究基础等）、体内作用机制、生物学特性（致病性、宿主范围、嗜肿瘤特性）以及生产工艺规模的可放大性等进行充分的考虑。如果使用当前认知尚不充分的病毒进行开发时，需要全面评估安全性风险并制定相应的控制策略。目前常用于溶瘤病毒产品开发的病毒来源包括野生病毒、减毒病毒和基因修饰病毒。 当采用野生病毒或减毒病毒进行产品开发时，病毒的来源、筛选、减毒操作和传代历史情况应明确，并需要对病毒结构和作用机制、病毒宿主范围和对人体致病性，以及病毒传代稳定性等进行研究和风险评估。另外，减毒病毒还应结合其减毒操作以及减毒目标开展毒力评价试验。 当采用基因修饰技术进行产品开发时，初始病毒的来源、培养情况（如适用）、传代历史（如适用）、初始病毒的遗传信息等情况应明确。基因修饰过程中，工具的选用与设计、操作过程、筛选方法等需要进行适当的研究并结合筛选结果说明其合理性。需要关注的是，研究结果需要说明是否达到基因修饰的预期目的，如基因的沉默或表达等；基因修饰后，病毒在感染活性、复制特性、毒力和致病性等方面是否产生非预期作用的风险，是否满足溶瘤病毒产品开发的质量要求。 1.1.2 病毒基因修饰设计的一般考虑 病毒基因修饰一般以降低对正常细胞杀伤性、增强肿瘤细胞靶向性、优化肿瘤微环境等提高安全性和有效性为目的。常见的基因修饰包括（但不仅限于）以下方面： （1）突变在正常细胞中复制比较关键的病毒编码基因。 （2）插入肿瘤特异性启动子以控制病毒早期基因表达。 （3）改变病毒的组织趋向性或病毒进入细胞的方式。 （4）病毒基因组中插入外源基因等。 （5）病毒外壳蛋白的改造和修饰以降低病毒本身的免疫原性和抗原性。 相应的，针对病毒基因修饰，一般需关注（但不仅限于）以下方面： （1）删除或突变病毒中与安全性相关的致病基因，如神经毒性基因、潜在致癌风险基因等。 （2）减少生产用载体与包装细胞的同源序列，减少包装质粒之间的同源序列；减少生产用载体与人体易感病毒或内源性病毒的同源序列，以降低回复突变或同源重组产生的风险。 （3）开展基因修饰后病毒遗传稳定性研究，特别关注经修饰后的基因稳定性，评估序列突变引入的潜在安全性风险或对有效性的影响。 （5）研究基因修饰后病毒的生长特性、对肿瘤细胞选择性和感染特性、细胞内的复制能力，以及神经毒性（如适用）等方面的变化。 1.1.3 病毒种子批的建立和检定 为了确保产品质量的一致性和稳定性，生产用病毒需采用种子批系统管理。在病毒种子批建立过程中，需采用合理的筛选技术进行病毒的单克隆筛选。病毒种子批建立过程中可能使用到的原材料如初始病毒、质粒 DNA 和包装细胞等需进行适当的研究和质量控制。 病毒种子批建立后，需开展相应的检定。检定项目应符合《中国药典》或其他通行技术指导原则的相关规定，并根据病毒种子自身特点设定相应的检定项目。检定项目一般包括鉴别（基因序列、血清型、电镜形态等）、病毒滴度、外源因子（细菌、真菌、支原体、分枝杆菌（如适用）、病毒等）、初始病毒（或野生型病毒）、功能性检测（如肿瘤选择性、病毒复制能力、裂解/杀伤肿瘤细胞能力等）、抗病毒药物敏感性（如适用）、目的蛋白鉴定和功能检测（如适用）、病毒物理特性（如适用）等。 病毒种子批保存容器、冻存剂和冷冻保存条件等需经过研究确认。种子批的层级（二级或三级种子批）和数量应满足生产的要求。 1.1.4 病毒种子批的稳定性 为了确保病毒在传代过程中的遗传稳定性和生物学特性等的稳定性，病毒种子批应开展规范的传代稳定性研究。传代研究条件应符合实际生产条件或具有代表性，研究项目建议涵盖全基因组测序并关注特定基因序列分析、产品质量（如病毒滴度、裂解/杀伤肿瘤细胞能力等）、目的蛋白鉴别和功能检测（如适用）、初始病毒（或野生型病毒）等。根据传代稳定性研究结果合理拟定病毒种子批的限传代次，并在实际生产过程中加以限定。需要关注的是，某些病毒在多次传代后易发生基因序列甚至氨基酸突变，因此建议加强病毒分子变体的研究。一般情况下，应对主种子和生产限传代次病毒进行全基因组分析，关注多次传代后病毒在基因序列和/或氨基酸序列上变化。可采用灵敏的、可量化的检测方法识别病毒全基因组中的所有突变，尤其关注改造区域或编码区域基因突变情况，充分评估突变对产品安全性和有效性的影响。 另外，为了确保病毒种子批在贮存过程中的稳定性，需要规范开展贮存稳定性研究。
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