1.2 质粒
DNA 质粒 DNA 可用于制备病毒种子，也可通过瞬时转染方式生产溶瘤病毒。根据研究确认各类质粒 DNA 的来源、序列信息、主要元件及功能等。 通常情况下，制备病毒种子的质粒 DNA 在构建过程中一次性使用，一般不需要建立细菌种子批，因而，需要对质粒 DNA 序列的完整性和准确性进行确认，同时避免操作过程中外源因子污染的风险。重组构建的病毒种子需进行单克隆筛选、建库及检定等，具体可参考前文。 瞬时转染方式用于生产溶瘤病毒产品的质粒 DNA，一般需要建立细菌种子批进行生产，其具体要求可参考《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》。 1.3 生产/包装细胞 1.3.1 生产/包装细胞选择的一般考虑 本指导原则的生产/包装细胞是指培养病毒时所使用的细胞，一般包括病毒种子构建过程中使用的细胞基质和生产病毒使用的细胞基质，两种细胞基质可能相同也可能不同。 原则上，生产/包装细胞的选择和使用应满足来源清晰、历史培养过程清楚、风险可控及经过全面检定的要求，以确保其适用性和安全性。选择细胞基质可以考虑（但不仅限于）以下方面： （1）细胞的种属及组织来源。 （2）细胞对病毒的敏感性以及能稳定生产病毒的能力。 （3）细胞的特性及全面检定的可行性。 （4）生产工艺的便利性和可行性。 （5）下游纯化工艺能够去除风险因素的可能性和达到的安全水平以及使用经验等。 目前溶瘤病毒产品开发中可能适用的生产/包装细胞类型较多，如正常细胞群连续传代建立的细胞系/株（如 Vero）、肿瘤细胞系/株（如 Hela、A549 等）、携带致瘤基因的传代细胞系/株（如 HEK293）等。原则上，应避免使用含有内源性病毒的细胞基质，如确因病毒生产需要，应提供充分的安全性评估研究数据。如适用，还需结合内源性病毒与溶瘤病毒在理化特性方面的差异，在生产工艺中设置病毒去除/灭活单元，并在产品或收获液阶段建立敏感的检测此类内源性病毒的方法。由于肿瘤细胞或携带肿瘤基因的细胞系成瘤或致瘤风险较高，建议谨慎选用。如使用具有成瘤性细胞，需要结合临床风险获益、给药途径和生产工艺对杂质（如活细胞残留、致瘤基因片段残留等）去除能力等评估使用的必要性、合理性和安全性。一般不建议使用具有致瘤性的细胞。对于新型细胞基质和新建细胞株/系，建议参考《中国药典》的相关要求评估其相关的安全性风险（如成瘤或致瘤等），并开展相应的研究。 如果根据生产需要，对细胞基质进行了基因修饰（如赋予病毒蛋白、允许病毒复制或包装等），应考虑基因修饰的必要性和修饰方法的适用性，修饰过程不应增加额外的安全性风险，修饰基因的选择应尽量避免或降低病毒包装过程发生重组的风险。 1.3.2 生产/包装细胞的建库和检定 为了保证产品质量的稳定性，生产/包装细胞需建库管理。细胞库的制备和检定应符合《中国药典》“生物制品生产检定用动物细胞制备及质量控制”和 ICH Q5D 等相关要求。检定项目一般包括：鉴别、细胞数量和活率、成瘤性和/或致瘤性（如适用）、外源因子等。 经基因修饰建立的稳定传代细胞系/株，除上述检定项目外，还应对基因修饰的结果，如基因序列、修饰位点、拷贝数、表达水平等进行研究确认。 1.3.3 生产/包装细胞的稳定性 为了确保生产/包装细胞在传代过程中可以稳定地生产出预期质量的溶瘤病毒，生产/包装细胞应开展规范的传代稳定性研究。传代稳定性研究条件应代表或模拟商业化生产工艺，其研究项目一般应包括如鉴别、外源因子、细胞生长特性、生产病毒能力和病毒产品质量等。新建细胞系的传代稳定性研究还需关注随着细胞传代代次增加成瘤性和/或致瘤性风险。经基因修饰建立的细胞系/株的传代稳定性研究还需关注传代过程中基因修饰部分的稳定性，如基因序列、拷贝数、蛋白表达稳定性。根据传代稳定性研究结果制定合理的限传代次，并在实际生产过程中加以限定。 另外，需开展规范的细胞库贮存稳定性研究，制定合理的贮存稳定性考察方案，关注在长期贮存过程中细胞活率、细胞生长特性、生产病毒能力等的变化。根据研究结果确定细胞库的贮存条件，细胞库在拟定的贮存条件下可满足生产需求。 2. 其他生产用物料 其他生产用物料系指除前述起始原材料外，在生产中使用的原材料，如培养基、细胞培养和生产中的添加成分、纯化试剂、辅料和生产过程中使用的关键耗材。 其他生产用物料的质量应符合其预期用途，其选用需要考虑其来源、组成、用途和质量控制情况等。应对可能影响产品质量的原材料在最终产品或工艺最适阶段中的残留情况进行研究和风险评估，必要时，设定合理的限度进行监控。 原则上，生产过程中应尽可能避免使用动物/人源材料（如牛血清、胰蛋白酶等）或可能对产品产生非预期影响的原材料（如酶、抗体、细胞因子、血清、抗生素、裂解剂、病毒稳定剂等），研究中应充分评估其使用的必要性、合理性和安全性，明确使用阶段及用量，并说明其预期用途，根据供应商检测报告和安全性评估拟定合理的企业内控标准。如某些关键原材料的检测标准是微生物限度，建议使用前进行除菌过滤以进一步确保安全性。对于牛血清、动物胰蛋白酶等，如有可能，建议尽量以成分明确的血清替代物或重组来源制品（如重组胰蛋白酶）替代。如经研究认为必须使用，应对其来源（如使用的动物是否来源于非疫区）、生产工艺（如是否采用 γ 射线辐照）、质量标准（如是否开展全面的外源因子检测）、TSE/BSE 风险等进行充分评估，并建立企业内控标准。另外，生产过程中不得使用青霉素等 β-内酰胺类抗生素、链霉素，以及其它如溴乙锭等有毒试剂。 辅料相关要求请见“六、生产工艺”项下“1.2.2 辅料”部分。 生产过程中使用的关键耗材，如一次性生物反应器、移液管路、一次性配液袋/储液袋、一次性除菌过滤器/过滤膜包等，应具有稳定的物理或化学特性，与直接接触的溶液、中间产物有较好的相容性。结合耗材的材质、使用阶段、供应商检测报告和生物相容性研究等因素综合评估使用耗材和容器的安全性。 |
