六、生产工艺 1. 工艺研究与开发 生产工艺开发系基于对产品已有的认知、研究基础和风险评估，以及工艺参数与产品关键质量属性的相关性，逐步建立工艺步骤和关键工艺参数。 工艺开发过程中常伴随工艺优化和调整，应充分评估这些变更对产品质量的影响，开展相应的可比性研究，可参考ICH Q5E 等相关指导原则的要求。早期临床试验阶段，由于生产工艺尚在完善，批次数量较少，可比性研究可根据有限批次的研究结果进行比较，需关注变更对产品相关质量属性如安全性（如杂质残留等）、滴度、纯度、生物学活性等的影响。随着研发进程不断推进和对产品生产工艺、质量属性认知的不断深入，可比性研究应更加全面，一般可能包括工艺性能（工艺参数和过程控制）、放行检测、扩展特性和稳定性研究等。由于目前认知有限，某些分析方法变异性可能较大，关键质量属性与临床有效性相关性尚不清楚或难以建立等因素，使得药学可比性存在较大的不确定性，建议对研究中观察到的质量差异进行充分评估。当现有认知或平台经验无法预测质量属性的差异对产品安全性和/或有效性的影响时，应考虑进一步开展非临床和/或临床的桥接研究。 1.1 原液生产工艺 目前常见的原液生产工艺包括细胞培养、病毒感染、病毒收获和病毒纯化等一系列操作过程。研究中需结合病毒和生产用细胞的特性采用适宜的培养方式，同时还应考虑病毒质量的可控性、工艺的可放大性、技术的成熟程度、工艺操作的便利性等进行设计和制定原液生产工艺。 结合充分的工艺研究和开发，确定细胞培养和收获工艺相关参数，如培养时间、培养温度、细胞密度、病毒感染复数（MOI）或质粒转染比例（如适用）、病毒收获条件等，并拟定合理的工艺参数范围。一般情况下，为确保产品质量批间一致性，病毒接种培养时，同一工作种子批需要根据研究并按照一定范围的 MOI 接种培养。纯化工艺需充分考虑病毒理化特性、病毒活性以及杂质去除效果等进行开发与研究，根据研究结果，确定工艺步骤和工艺参数。 1.2 制剂生产工艺 1.2.1 制剂处方研究 结合质量研究和稳定性研究对辅料类型、用量等进行筛选，研究过程中建议关注病毒滴度、纯度、生物学活性、不溶性微粒、可见异物等质量属性的变化，如制剂类型为冻干剂，还需研究冷冻干燥和复溶后样品外观、pH 值、水分等质量属性的变化。溶瘤病毒产品常见低温冷冻条件下保存，因而制剂处方中一般含有冷冻保护剂、冻干保护剂等功能性辅料，建议在处方筛选研究中充分开展冷冻保护剂和冻干保护剂的种类、加入量的研究。在确保产品稳定的前提下，尽可能选择组分明确、质量可控、安全性风险较小的辅料。 1.2.2 辅料 制剂辅料质量应满足其预期功能，并符合《中国药典》通则“生物制品生产用原材料及辅料的质量控制”的相关要求。 辅料的选择和用量应基于充分的制剂处方筛选研究和开发，处方中应尽可能避免使用动物/人源辅料，如必须使用，应开展充分的研究以证明其使用的必要性、安全性和合理性。处方中如果使用新型辅料，需进行充分的生产工艺、质量、稳定性等研究，做好供应商审核等，制定相应的质量标准/内控标准，并参照《新药用辅料非临床安全性评价指导原则》进行相关的研究。 1.2.3 制剂工艺研究 制剂生产工艺一般指从纯化原液或配制原液（如适用）到最终制剂的过程。制剂工艺研究中应考虑配制、除菌过滤（如适用）、灌装、冻干（如适用）等操作步骤，结合工艺开发和研究，制定合理的工艺步骤和参数范围。由于溶瘤病毒是具有复制能力的活病毒，为降低其在生产过程中的传播风险，建议尽可能采用密闭灌装方式。另外，制剂生产规模建议与原液生产规模相匹配，尽量避免采用不同批次原液混合后进行半成品或成品制备的情况。在某些情况下，限于病毒的物理性质，工艺步骤中无法进行除菌过滤操作，则应加强生产用原材料的质量控制和加强生产工艺过程控制，以及制定相应措施等，控制污染风险。 1.3 工艺过程控制 为确保工艺过程的重现性和产品质量的批间一致性，强化生产过程中的风险排查，应制定合理的工艺过程控制项目和可接受标准。工艺过程控制项目应结合工艺特点和产品特点综合考虑确定，如，细胞传代次数、细胞密度、细胞活率、病毒滴度、纯度和杂质、生物学活性等。另外，工艺过程控制中还应关注微生物安全相关项目的检测和控制，建议在生产工艺的合适阶段进行微生物限度或无菌、细菌内毒素、外源病毒因子和支原体等安全性项目的监控。某些工艺过程控制项目需采用快速检测方法，则需进行充分的研究与验证，并建议与《中国药典》方法进行比较研究（如适用）。 2. 工艺验证 工艺验证的目的是证明已经确定的生产工艺能否按照拟定的工艺步骤和参数持续稳定的生产出符合预期标准的产品。一般情况下，商业化生产工艺确定后，应在上市申请前采用代表性商业化生产工艺和规模进行规范的工艺验证，并在上市申请时提供完整的工艺验证报告。验证研究的批次数量应结合工艺复杂程度，工艺可变性水平，前期工艺研究的充分性和数据积累水平，以及对生产工艺的认知水平等综合考虑，一般不少于三批，如有其他特殊情况，建议提前与监管机构开展沟通交流。验证研究的结果应能证明工艺的稳健性、可控性，以及过程控制项目和验收标准设定的合理性。 此外，验证研究可能还包括（但不限于）培养基/缓冲液制备和放置条件验证、层析填料使用寿命验证、除菌过滤验证、无菌工艺模拟验证、关键原材料灭菌性能验证等。如生产工艺过程中涉及到中间体暂存，需提供支持其暂存条件和时间的验证数据。 七、质量研究和质 产品研发过程中需对产品的质量进行全面、系统、深入的研究，制定出科学、合理、可行的质量标准，并不断地修订和完善，确保其安全、有效。 1. 质量研究 质量研究需选择代表性工艺批次（如非临床研究批次、临床研究批次和/或商业化工艺批次等）以及适当生产阶段的样品（如起始原材料、工艺中间体、原液、制剂等）作为研究对象，采用物理化学、生物学和免疫学等一系列分析方法进行研究。研究项目需全面充分，尽可能涵盖所有可能与产品安全性、有效性相关的质量项目，一般包括鉴别和结构分析，生物学活性，含量，纯度、杂质和污染物，以及其他特性等。 1.1 鉴别和结构分析 建议采用多种技术手段和方法对病毒基因组、病毒形态和结构等进行鉴别。基因组水平可采用测序、限制性内切酶、PCR 等方法对病毒基因组、目的基因或调控基因特定序列进行确认。一般情况下，限制性内切酶法和 PCR 等方法仅能对某些特征性序列进行确认，无法获得全基因组序列中的其他非预期突变的信息，因而建议采用代表性生产工艺的若干批次进行全基因组测序。如在测序中发现基因序列或位点的突变，应对突变原因进行分析，开展分子变体对产品安全性和有效性影响的评估，也可基于文献报道和/或根据其对蛋白质相互作用或功能潜在影响的模型进行评估。 病毒形态和结构的鉴别一般在颗粒完整性和蛋白质水平进行分析，通常可采用电镜法对病毒颗粒结构、颗粒大小分布等进行分析。蛋白质鉴别可采用蛋白电泳、免疫印迹、免疫中和试验（血清型鉴别）等进行分析。 1.2 生物学活性 根据产品的作用机制、生物学特性和基因修饰目的等建立可反映体内作用机制的生物学活性指标。如果产品设计有多种功能，建议分别建立相应的活性检测方法，根据活性与产品作用机制的相关性，确定一项或多项适宜的活性检测方法作为质量放行检测项目。生物学活性可采用体外法检测溶瘤病毒产品对代表性易感肿瘤细胞的毒性/裂解作用和/或其在细胞中的复制能力等，或采用动物/人体肿瘤细胞原代培养物进行检测。在某些情况下，当体外实验并不能完全反映溶瘤病毒产品的体内效应时，可考虑采用动物体内检测方法进行检测。在有些溶瘤病毒产品中，生物学活性检测还需要结合转基因表达水平和生物学特性进行定量和定性分析。生物学活性分析中，需要建立和使用适当的标准品，用于标定待测样品的相对效价或计算待测样品的 IC50 值。
|
