5. 与血浆蛋白的结合 一般情况下，只有游离型药物才能通过脂膜向组织扩散，被肾小管滤过或被肝脏代谢，因此药物与蛋白的结合会明显影响药物分布与消除的动力学过程，并降低药物在靶部位的浓度。建议根据药理毒理研究所采用的动物种属，进行动物与人血浆蛋白结合率比较试验，以预测和解释动物与人在药效和毒性反应方面的相关性。 研究药物与血浆蛋白结合可采用多种方法，如平衡透析法、超过滤法、分配平衡法、凝胶过滤法、色谱法等。根据药物的理化性质及试验室条件，可选择使用一种方法进行至少3个浓度（包括有效浓度）的血浆蛋白结合试验，每个浓度至少重复试验３次，以了解药物与血浆蛋白结合率以及可能存在的浓度依赖性和血浆蛋白结合率的种属差异。 对血浆蛋白结合率高，且安全范围窄的药物，建议开展体外药物竞争结合试验，即选择临床上有可能合并使用的高蛋白结合率药物，考察对所研究药物蛋白结合率的影响。 6. 生物转化 对于创新性的药物，尚需了解在体内的生物转化情况，包括转化类型、主要转化途径及其可能涉及的代谢酶表型。对于新的前体药物, 除对其代谢途径和主要活性代谢产物结构进行研究外, 尚应对原形药和活性代谢产物进行系统的药代动力学研究。而对主要在体内以代谢消除为主的药物(原形药排泄<50%)，生物转化研究则可分阶段进行：临床前可先采用色谱方法或放射性同位素标记方法分析和分离可能存在的代谢产物，并用色谱-质谱联用等方法初步推测其结构。如果临床研究提示其在有效性和安全性方面有开发前景，需进一步研究并阐明主要代谢产物的代谢途径、结构及酶催化机制。但当多种迹象提示可能存在有较强活性或毒性的代谢产物时，应尽早开展活性或毒性代谢产物的研究，以确定开展代谢产物动力学试验的必要性。 体内药物生物转化可考虑与血药浓度-时间曲线和排泄试验同时进行，应用这些试验采集的样品进行代谢产物的鉴定及浓度测定。 应尽早考察药效和毒性试验所用的实验动物与人体代谢的差异。这种差异有两种情况，其一是量的差异，动物与人的代谢产物是一致的，但各代谢产物的量不同或所占的比例不同；其二是质的差异，即动物与人的代谢产物是不一致的，这时应考虑这种代谢的种属差异是否会影响到其药效和毒性，并以此作为药效和毒性试验动物选择的依据。建议在早期非临床药代动力学研究时，进行药物体外（如动物和人肝组织匀浆、原代肝细胞、肝S9、肝微粒体等）代谢试验，以预测动物与人体体内代谢有无差异。 7. 药物代谢酶及转运体研究 药物的有效性及毒性与血药浓度或靶器官浓度密切相关。一定剂量下的血药浓度或靶器官浓度取决于该药物的吸收、分布、代谢及排泄过程（ADME），而代谢酶和转运体是影响药物体内过程的两大生物体系，是药物ADME的核心机制之一。因此，创新性药物的研究开发应该重点关注药物吸收和主要消除途径的确定、代谢酶和转运体对药物处置相对贡献的描述、基于代谢酶或转运体的药物-药物相互作用的评估等。 体外试验体系是评价药物代谢酶和转运体作用机制的有力手段，应结合体内试验，综合评价药物的处置过程。非临床ADME研究应主要采用人源化材料（如：人肝微粒体、肝S9、原代肝细胞及P450重组酶等），鉴定药物是否是代谢酶的底物或抑制剂。P450同工酶之外的药物代谢酶，如葡萄糖醛酸结合酶、硫酸转移酶等，也应该在适当的情况下进行评估。 对细胞色素P450同工酶（CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4等）抑制的考察可以通过使用类药性探针底物（Drug-like Probe Substrate）完成。抑制试验应该在酶动力学线性范围进行，即探针底物药物的浓度£Km（米氏常数），抑制强弱通过IC50或Ki判断。P450同工酶抑制试验的思路与方法适用于其他药物代谢酶和转运体的研究评价。药物对P450酶的诱导应该重点对人CYP3A4以及CYP1A2、CYP2B6进行评估。体外诱导试验可运用人肝细胞多次给药后相关mRNA表达和/或酶活性的变化进行评价。 具有重要临床意义的外排和摄入转运体主要包括P-gp、BCRP、OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3和OCT2等，建议针对这些转运体进行研究。除此之外的其他转运体研究，在必要时也可予以考虑。 创新药物非临床ADME研究还应该考虑到代谢酶与转运体之间的相互影响及潜在的相互作用、人特异性代谢产物的评估等。 8. 物质平衡 在临床前和临床早期阶段，特别是毒性剂量和有效治疗剂量范围确定的情况下运用放射性标记化合物，可通过收集动物和人体粪、尿以及胆汁以研究药物的物质平衡。这些研究能够获得化合物的排泄途径和排泄速率等信息，而且有助于代谢产物的性质鉴定，并通过有限的数据比较它们的体内吸收和分布特点。通过体外和动物样品中分离出的代谢产物有时可作为参比品用于临床和非临床的定量研究。同时，组织分布研究和动物胆管插管收集的胆汁能够提供药物的组织分布数据和明确胆汁清除特点。一般应采用放射性同位素标记技术研究物质平衡。有关试验方法的介绍及相关考虑见附录（二）。 考虑到每一个化合物及其代谢产物具有各自的理化特性，在开展不同化合物的同位素标记研究时对试验方法作慎重的调整/修改是很有必要的。
四、数据处理与分析 应有效整合各项试验数据，选择科学合理的数据处理及统计方法。如用计算机处理数据，应注明所用程序的名称、版本和来源，并对其可靠性进行确认。
五、试验结果与评价 对所获取的数据应进行科学和全面的分析与评价，综合论述药物在动物体内的药代动力学特点，包括药物吸收、分布和消除的特点；经尿、粪和胆汁的排泄情况；与血浆蛋白结合的情况；药物在体内蓄积的程度及主要蓄积的器官或组织；如为创新性的药物，还应阐明其在体内的生物转化、消除过程及物质平衡情况。 在评价的过程中注意进行综合评价，分析药代动力学特点与药物的制剂选择、有效性和安全性的关系，从体外试验和动物体内试验的结果，推测临床药代动力学可能出现的情况，为药物的整体评价和临床研究提供更多有价值的信息。
六、附录 （一）生物样品分析方法的基本要求 1. 基本概念 生物样品分析方法的基本参数包括：（1）准确度，（2）精密度，（3）特异性，（4）灵敏度，（5）重现性，（6）稳定性。现将相关的概念介绍如下： 准确度：在确定的分析条件下，测得值与真实值的接近程度。 精密度：在确定的分析条件下，相同基质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。 特异性：分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这些共存组分可能包括代谢产物、杂质、分解产物、基质组分等。 灵敏度：生物样品分析方法的灵敏度主要通过测定定量下限样品的准确度和精密度来表征。 重现性：不同试验室间测定结果的分散程度，以及相同条件下分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。 稳定性：一种分析物在确定条件下，一定时间内在给定基质中的化学稳定性。 标准曲线：试验响应值与分析物浓度间的关系。应采用适当的加权和统计检验，用简单的数学模型来最适当地描述。标准曲线应是连续的和可重现的，应以回归计算结果的百分偏差最小为基础。 提取回收率：分析过程的提取效率，以样品提取和处理过程前后分析物含量百分比表示。 定量范围：包括定量上限（ULOQ）和定量下限（LLOQ）的浓度范围，在此范围内采用浓度-响应关系能进行可靠的、可重复的定量，其准确度和精密度可以接受。 生物基质：一种生物来源物质，能够以可重复的方式采集和处理。例如全血、血浆、血清、尿、粪、各种组织等。 基质效应：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。 分析批：包括待测样品、适当数目的标准样品和质控样品的完整系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成。 标准样品：在生物基质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。 质控样品：即QC样品，系指在生物基质中加入已知量分析物配制的样品，用于监测生物分析方法的重复性和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。
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