四、BA 和
BE 研究具体要求 以药代动力学参数为终点指标的研究方法是目前普遍采用的生物等效性研究方法。一个完整的生物等效性研究包括生物样本分析、实验设计、统计分析、结果评价四个方面内容。 （一）生物样本分析方法的建立和确证 生物样品一般来自全血、血清、血浆、尿液或其他组织，具有取样量少、药物浓度低、干扰物质多以及个体的差异大等特点，因此必须根据待测物的结构、生物介质和预期的浓度范围，建立适宜的生物样品定量分析方法，并对方法进行确证。 1. 常用分析方法 目前常用的几种分析方法有： （1）色谱法：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱－质谱联用法（LC－MS、LC-MS-MS、GC-MS、GC-MS-MS）等，可用于大多数药物的检测；（2）免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；（3）微生物学方法，可用于抗生素药物的测定。 生物样本分析方法的选择宜尽量选择可行的灵敏度高的方法。 2. 方法学确证（Method
Validation） 建立可靠的和可重现的定量分析方法是进行生物等效性研究的关键之一。为了保证分析方法可靠，必须进行充分的方法确证，一般应进行以下几方面的考察： 2.1 特异性(Specificity) 特异性是指样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力。必须提供证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得干扰对样品的测定，如果有几个分析物，应保证每一个分析物都不被干扰。应确定保证分析方法特异性的最佳检测条件。对于色谱法至少要考察 6 个来自不同个体的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图反映分析方法的特异性。对于以软电离质谱为基础的检测法（LC－MS、LC-MS-MS）应注意考察分析过程中的介质效应，如离子抑制等。 2.2 标准曲线和定量范围（Calibration Curve）
标准曲线反映了所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系，一般用回归分析方法（如用加权最小二乘法）所得的回归方程来评价。应提供标准曲线的线性方程和相关系数，说明其线性相关程度。标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。 配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，不同生物样品应制备各自的标准曲线，用于建立标准曲线的标准浓度个数取决于分析物可能的浓度范围和分析物/响应值关系的性质。必须至少用 6 个浓度建立标准曲线，对于非线性相关可能需要更多浓度点。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点，仅用于评价干扰。标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差*（* 偏差=【（实测值－标示值）/标示值】X100% ）在可接受的范围之内时，可判定标准曲线合格。可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能对临床待测样品进行定量计算。当线性范围较宽的时候，推荐采用加权的方法对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。 2.3 定量下限（Lower
Limit of quantitation，LLOQ） 定量下限是标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。LLOQ 应能满足测定 3～5 个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出 Cmax 的 1／10～1／20 时的药物浓度。其准确度应在真实浓度的 80%～120%范围内，相对标准差(RSD)应小于 20%。应至少由 5 个标准样品测试结果证明。 2.4 精密度与准确度(Prcision and Accuracy) 精密度是指在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。通常用质控样品的批内和批间 RSD 来考察方法的精确度。一般 RSD 应小于 15％，在 LLOQ 附近 RSD 应小于 20％。 准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度(即质控样品的实测浓度与真实浓度的偏差)，重复测定已知浓度分析物样品可获得准确度。一般应 85％～115％范围内，在 LLOQ 附近应在80％～120％范围内。 一般要求选择高、中、低 3 个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在 LLOQ 的 3 倍以内，高浓度接近于标准曲线的上限，中间选一个浓度。在测定批内精密度时，每一浓度至少制备并测定 5 个样品。为获得批间精密度应至少在不同天连续制备并测定 3 个合格的分析批(Analytical run/Analytical batch)，至少 45 个样品。 2.5 样品稳定性(Stability) 根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻或冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性，以保证检测结果的准确性和重现性。 2.6 提取回收率 从生物样本基质中回收得到分析物质的响应值除以纯标准品产生的响应值即为分析物的提取回收率。也可以说是将供试生物样品中分析物提取出来供分析的比例。应考察高、中、低 3 个浓度的提取回收率，其结果应当精密和可重现。 2.7 微生物学和免疫学方法确证 上述分析方法确证主要针对色谱法，很多参数和原则也适用于微生物学或免疫学分析，但在方法确证中应考虑到它们的一些特殊之处。微生物学或免疫学分析的标准曲线本质上是非线性的，所以应尽可能采用比化学分析更多的浓度点来建立标准曲线。结果的准确度是关键的因素，如果重复测定能够改善准确度，则应在方法确证和未知样品测定中采用同样的步骤。 3. 方法学质控 只有在生物样本分析方法确证完成之后才能开始测定未知样品。在测定生物样品中的药物浓度时应进行质量控制，以保证所建立的方法在实际应用中的可靠性。推荐由独立的人员配制不同浓度的质控样品对分析方法进行考核。 每个未知样品一般测定一次，必要时可进行复测。生物等效性试验中，来自同一个体的生物样品最好在同一批中测定。每个分析批生物样品测定时应建立新的标准曲线，并随行测定高、中、低三个浓度的质控样品。每个浓度至少双样本，并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批中未知样品数目较多时，应增加各浓度质控样品数，使质控样品数大于未知样品总数的 5%。质控样品测定结果的偏差一般应小于 15%，低浓度点偏差一般应小于 20%，最多允许 1/3 的质控样品结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度质控样品中。如质控样品测定结果不符合上述要求，则该分析批样品测试结果作废。 浓度高于定量上限的样品，应采用相应的空白介质稀释后重新测定。对于浓度低于定量下限的样品，在进行药代动力学分析时，在达到 Cmax以前取样的样品应以零值计算，在达到 Cmax 以后取样的样品应以无法定量（Not detectable, ND）计算，以减小零值对 AUC 计算的影响。
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