（二）急性毒性试验常用试验方法 由于受试物的化学结构、活性成分的含量各异，毒性反应的强弱也不同，研究者应根据受试物的特点，选择以下方法或国内外公认的试验方法。 本指导原则简单介绍下列常用的试验方法，详细的实验技术细节可参考相应的文献。 1、近似致死剂量法 该方法主要用于非啮齿类的动物试验。试验方法如下： 一般采用 6 只健康的 Beagle 犬或猴。犬的年龄一般为 4-6 月龄，猴的年龄一般为 2-3 岁，选用其他动物时应说明理由。 根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和其它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按 50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。 根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用二者之间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。 2、最大给药量法 对于某些低毒的受试物可采用该方法。在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂量单次给药或 24 小时内多次给药(剂量一般不超过 5g/kg 体重)，观察动物出现的反应。一般使用 10-20 只动物，连续观察 14 天。 3、固定剂量法（Fixed-dose
procedure）[7] 该方法最初于 1984 年由英国毒理学会提出[8]，不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为终点进行评价。 试验选择 5、50、500 和 2000mg/kg 四个固定剂量进行试验，特殊情况下可增加 5000 mg/kg 剂量。实验动物首选大鼠，给药前禁食 6-12 小时，给受试物后再禁食 3-4 小时。采用一次给药的方式进行。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试物的有关资料，从上述四个剂量中选择一个作为初始剂量；若无有关资料可作参考时，可用 500mg/kg 作为初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用 2000 mg/kg 进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过 5 只动物。每个剂量试验之间至少应间隔 24 小时。给受试物后的观察期至少 7 天，如动物的毒性反应到第 7 天仍然存在，尚应继续观察 7 天。 在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少用 10 只动物，雌雄各半。根据预试的结果，在上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，5.0mg/kg 引起死亡，则降低一个剂量档次进行试验。 给受试物后至少应观察 2 周，根据毒性反应的具体特点可适当延长。对每只动物均应仔细观察并详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。给受试物当天至少应观察记录两次，以后可每天一次。观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等。动物死亡时间的记录要准确。给予受试物前、后各 1 周、动物死亡及试验结束时应称取动物的体重。所有动物包括死亡或处死的动物均应进行尸检，尸检异常的器官应作组织病理学检查。固定剂量试验法所获得的结果，参考下表标准进行评价。 固定剂量法试验结果的评价 4、上下法（阶梯法，序贯法，Up
and down method）[9,10] 该方法由Dixon和Mood首次提出，1985 年Bruce又进行了改进，目前是OECD和EPA推荐的方法之一。其最大的特点是节省实验动物，同时，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的药物。该方法分为限度试验和主试验。限度试验主要用于有资料提示受试物毒性可能较小的情况。可以从与受试物相关的化合物或相似的混合物或产品中获得相关毒性资料。在相关毒性资料很少或没有时，或预期受试物有毒性时，应进行主试验。 限度试验：是最多用 5 只动物进行的序列试验。试验剂量为 2000 mg/kg，特殊情况下也可使用 5000 mg/kg。 2000 mg/kg剂量水平的限度试验: 将受试物给予 1 只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，依次将受试物给予另外 4 只动物，12 动物总数为 5 只。如果 1 只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价: 有 3 只或 3 只以上动物死亡时，LD50小于 2000mg/kg；有 3 只或 3 只以上动物存活时，LD50大于 2000 mg/kg；如果有 3 只动物死亡，则进行主试验。 5000mg/kg剂量水平的限度试验: 特殊情况下，可考虑使用 5000 mg/kg的剂量。将受试物给予 1 只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，将受试物给予另外 2 只动物。如果这 2 只动物都存活，则LD50大于 5000 mg/kg，停止试验（即不再对其他动物给药，观察 14 天）。如果这 2 只动物中有 1 只死亡或者 2 只均死亡，将受试物给予另外 2 只动物，一次 1 只。如果 1 只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价。有 3只或 3 只以上动物死亡时，LD50小于 5000 mg/kg；有 3 只或 3 只以上动物存活时，LD50大于 5000 mg/kg。 主试验: 由一个设定的给药程序组成，在此程序中，每次给药 1 只动物，间隔至少 48 小时。给药间隔取决于毒性出现时间、持续时间和毒性的严重程度。在确信前一只动物给药后能存活之前，应推迟按下一剂量给药。时间间隔可以适当调整，但使用单一时间间隔时，试验会更简便。 第一只动物的给药剂量低于LD50的最接近的估计值。如果该动物存活，第二只动物给予高一级剂量；如果第一只动物死亡或出现濒死状态，第二只动物给予低一级剂量。剂量级数因子应选定为 1/（剂量-反应曲线斜率估计值）的反对数（对应于斜率 2 的级数因子为 3.2），并应在整个试验过程中保持不变。当没有受试物的斜率的有关资料时，使用 3.2 为剂量级数因子。使用默认级数因子时，剂量应从以下序列中选择：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000 mg/kg（或有特殊要求时 1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000 mg/kg）。如果没有受试物的致死估计值，应该从 175 mg/kg开始。如果预期动物对该受试物的耐受程度变化很大（即，估计斜率小于 2.0），那么开始试验前应考虑增加剂量级数因子超过按对数剂量计算的默认值 0.5（即，级数因子为 3.2）。同样，对于已知斜率很陡的受试物，应选择小于默认值的级数因子。 在决定是否及如何对下一只动物给药之前，每只动物都应认真观察达48 小时。当满足停止试验标准之一时，停止给药，同时根据终止时所有动物的状态计算LD50估计值和可信区间。 用最大可能性法计算LD50值 (美国EPA开发了相应的计算软件，AOT425StatPgm)。
当满足下列停止试验标准之一时，停止试验： （a） 连续 3 只动物存活； （b） 任意连续 6 只试验动物中有 5 只连续发生存活/死亡转换； （c） 第一只动物发生转换之后至少有 4 只动物进入试验，并且其LD50 估算值的范围超出临界值（2.5 倍）。（首次转换的第 4 只动物之后，对每次给药进行计算）。 对于LD50和斜率的各种组合，在动物发生死亡/存活转换之后，用 4~6只动物即可满足停止试验标准（C）。但在一些情况下，化合物的剂量-反应曲线的斜率较小，可能另外还需要增加动物（总共可达 15 只）。 以上为该试验方法的概述，详细的试验方法可参见相应参考文献[11]。
用于该方法的LD50计算软件可从以下地址免费下载： http://www.epa.gov/oppfead1/harmonization/ 5、累积剂量设计法（金字塔法，Pyramiding
dosage design） 在非啮齿类动物进行急性毒性试验可采用此方法。经典的试验设计需要 8 只动物，分对照组和给药组，每组 4 只动物，雌雄各 2 只。 剂量的设计可以是 1、3、10、30、100、300、1000、3000 mg/kg，也可以采用 10、20、40、80、160、320、640、1280 mg/kg，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时为止。 当没有动物死亡时，MLD（最小致死剂量）和LD50大于最高剂量或受限制剂量。当在某一剂量所有动物均出现死亡时，MLD和LD50应在最后两个剂量之间。当在某一剂量部分动物出现死亡，部分死亡出现在后继的下一个高剂量，此时，MLD位于首次出现死亡的剂量和前一低剂量之间，LD50则应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间。假如没有动物死亡发生，常常以最高剂量给予动物 5-7 天，以确定后续的重复给药试验中高剂量的选择。 6、半数致死量法 是一种经典的急性毒性试验方法，试验结果经统计学处理可获得受试物的LD50。
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