（四）方法学研究 1、方法的选择及验证的一般原则 通常应针对研究项目的目的选择有效的质量研究用试验方法。方法的选择要有依据，包括文献的、理论的及试验的依据。常规项目可采用药典收载的方法, 视不同情况进行相应的方法验证工作，以保证所用方法的可行性；针对所研究药品的试验方法，应经过详细的方法学验证，确认方法的可行性。具体内容可参阅《化学药物质量分析方法验证的技术指导原则》。 2、常规项目试验的方法 常规试验可参照现行版《中华人民共和国药典》凡例和附录收载的方法进行。如溶解度、熔点、旋光度或比旋度、吸收系数、凝点、馏程、相对密度、折光率、黏度、碘值、酸值、皂化值、羟值、pH 值、水分、干燥失重、粒度、重金属、炽灼残渣、砷盐、氯化物、硫酸盐、溶液的澄清度与颜色、崩解时限、热原（剂量要经过实验探索，或参考有关文献）、细菌内毒素、微生物限度、异常毒性、升压物质、降压物质、不溶性微粒、融变时限、重（装）量差异等。同时还应考虑所研究药品的特殊情况，注意药典方法是否适用，杂质、辅料等是否对试验结果有影响等问题。必要时可对方法的操作步骤等做适当的修订，以适应所研究药品的需要，但修订方法需要有相应的试验或文献依据。若采用与现行版药典不同的方法，则应进行详细的方法学研究，明确方法选择的依据，并通过相应的方法学验证以证实方法的可行性。 3、针对所研究药品的试验方法 针对所研究药品的试验方法，如鉴别、杂质检查、残留溶剂检查、制剂的溶出度或释放度检查，以及含量测定等，均应在详细的方法学研究基础上确定适宜的试验方法。关于方法学验证的具体要求可参阅《化学药物质量控制分析方法验证的技术指导原则》、《化学药物杂质研究的技术指导原则》、《化学药物有机溶剂残留量研究的技术指导原则》等相关的技术指导原则，以及现行版《中华人民共和国药典》附录中有关的指导原则。 3.1 鉴别 原料药的鉴别试验常用的方法有化学反应法、色谱法和光谱法等。化学反应鉴别试验应明确反应原理，特别在研究结构相似的系列药物时，应注意与可能存在的结构相似的化合物的区别，并要进行实验验证。光学异构体药物的鉴别应具有专属性。对一些特殊品种，如果用以上三类方法尚不能鉴别时，可采用其它方法，如用粉末 X-射线衍射方法鉴别矿物药和不同晶型等。 制剂的鉴别试验，其方法要求同原料药。通常尽可能采用与原料药相同的方法，但需注意：（1）由于多数制剂中均加有辅料，应排除制剂中辅料的干扰。（2）有些制剂的主药含量甚微，必须采用灵敏度高、专属性强、操作较简便的方法，如色谱法等。 3.2 杂质检查 杂质检查通常采用色谱法，研发者可根据杂质的性质选用专属性好，灵敏度高的薄层色谱法、高效液相色谱法和气相色谱法等，有时也可采用呈色反应等方法。 原料药通常采用粗产品、起始原料、中间体和破坏试验降解产物对杂质的检查方法进行优化，确定适宜的试验条件。 现代色谱法是杂质检查的首选方法。薄层色谱法设备简单，操作简便。气相色谱法可用于检查挥发性的杂质，不挥发的物质需采用衍生化试剂制备成挥发性的衍生物后进行测定。高效液相色谱法可用于多数药物杂质的检查，具有灵敏度高、专属性好的特点。毛细管电泳法分离性能好、操作时间短，也可采用。如单用色谱法检查杂质尚不能满足要求时，在新药研究开发阶段还可采用 HPLC／二极管阵列检测器（DAD），HPLC／质谱（MS）或 GC／MS 等方法对被测定的杂质进行定性和定量分析。 高效液相色谱法用于测定杂质含量时，应参照现行版《中华人民共和国药典》附录的要求，并根据杂质的实际情况，可以选择（1）杂质对照品法；（2）加校正因子的自身对照法；（3）不加校正因子的自身对照法。由于不同物质的响应因子会有不同，因此，应对杂质相对于主成分的响应因子进行详细的研究，并根据研究结果确定适宜的方法。 制剂中杂质的检查方法基本同原料药，但要研究制剂中辅料对杂质检查的干扰，并应设法排除辅料的干扰。 3.3 溶出度 溶出度检查方法的选择：转篮法，以 100 转／分钟为主；桨法，以 50转／分钟为主。溶出量一般为 45 分钟 70%以上，小杯法用于规格小的品种。 溶出介质通常采用水、0.1mol/L 盐酸溶液、缓冲液（pH 值 3－8 为主）。对在上述溶出介质中均不能完全溶解的难溶性药物，可加入适量的表面活性剂，如十二烷基硫酸钠等。若介质中加入有机溶剂，如异丙醇、乙醇等应有试验或文献的依据，且尽量选用低浓度，必要时应与生物利用度比对。 溶出度测定首先应按规定对仪器进行校正，然后对研究制剂的溶出度测定方法进行研究，如选择转速、介质、取样时间、取样点等。待以上条件确定后，还应对该测定条件下的线性范围、溶液的稳定性、回收率等进行考察；胶囊剂还应考察空心胶囊的影响。在研究新药的口服固体制剂时，不论主药是否易溶于水，在处方和制备工艺研究中均应对溶出情况进行考察，以便改进处方和制备工艺。主药易溶于水的品种，如制剂过程不改变其溶解性能，溶出度项目不一定订入质量标准。如是仿制已有国家标准的药品，则应与被仿制的制剂进行溶出度比较。 溶出度测定时，取样数量和对测定结果的判断可按现行版《中华人民共和国药典》附录的规定进行。测定中除按规定的条件外，还应注意介质的脱气、温度控制，以及取样位置等操作。使用桨法时，因样品的位置不如转篮法固定，使得检查结果可能产生较大的差异，故必要时需进行两种方法的比较。 3.4 释放度 缓释与控释制剂，按《中华人民共和国药典》附录释放度第一法检查。肠溶制剂，按《中华人民共和国药典》附录释放度第二法检查。透皮贴剂，按《中华人民共和国药典》附录释放度第三法检查。释放度检查所用的溶出介质，原则上与溶出度相同，但缓控释制剂应考察其在不同 pH 介质中的释放情况。如为仿制已有国家标准的药品，还应与被仿制产品进行释放度的比较。 3.5 含量测定 原料药的纯度要求高，限度要求严格。如果杂质可严格控制，含量测定可注重方法的准确性，一般首选容量分析法。用生物效价法测定的原料药，若改用理化方法测定，需对两种测定方法进行对比。 由于紫外分光光度法的专属性低，准确性又不及容量法，一般不用于原料药的含量测定；若确需采用紫外分光光度法测定含量时，可用对照品同时测定进行比较计算，以减少不同仪器的测定误差。 气相色谱法一般用于具有一定挥发性的原料药的含量测定。高效液相色谱法与气相色谱法一样具有良好的分离效果，主要用于多组分抗生素、甾体激素类和用其他测定方法受杂质干扰的原料药的含量测定。定量方法有外标法和内标法（气相色谱一般采用内标法）。外标法所用的对照品应有确定的纯度，在适当的保存条件下稳定。内标物质应选易得的，不对测定产生干扰的，且保留时间和响应与被测物接近的化学物质。所用的填充剂一般首选十八烷基硅烷键合硅胶；如经试用上述填充剂不合适，可选用其他填充剂。流动相首选甲醇-水或乙腈－水系统。 制剂含量测定要求采用的方法具有专属性和准确性。由于制剂的含量限度一般较宽，故可选用的方法较多，主要有：（1）色谱法。主要采用高效液相色谱法和气相色谱法。复方制剂或需经过复杂分离除去杂质与辅料干扰的品种，或在鉴别、检查项中未能专属控制质量的品种，可以采用高效液相色谱法或气相色谱法测定含量。（2）紫外分光光度法。该法测定宜采用对照品法，以减少不同仪器间的误差。若用吸收系数（E1％1cm）计算，其值宜在 100 以上；同时还应充分考虑辅料、共存物质和降解产物等对测定结果的干扰。测定中应尽量避免使用有毒的及价格昂贵的有机溶剂，宜用水、各种缓冲液、稀酸、稀碱溶液作溶剂。（3）比色法或荧光分光光度法。当制剂中主药含量很低或无较强的发色团，以及杂质影响紫外分光光度法测定时，可考虑选择显色较灵敏、专属性和稳定性较好的比色法或荧光分光光度法。 制剂的含量测定一般首选色谱法。
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