五、附录 （一）躯体依赖性试验 1、小鼠跳跃试验（催促戒断试验） （1）原理：短期内重复大剂量给药，然后注射阿片受体拮抗剂，如受试物属于阿片类药物，则动物发生跳跃反应，跳跃次数可反应依赖性程度。 （2）动物：健康小鼠。 （3）实验步骤：药物剂量常按递增法，有时也配合采用恒量法，给药总量可按镇痛ED50的倍数计算。连续给药数天（根据药物镇痛作用的强弱确定给药时间），末次药后2h（以吗啡为例）腹腔注射纳络酮，观察30min内的跳跃动物数及跳跃次数，还可观察1h内的小鼠体重减轻程度。 2、大鼠体重减轻试验（自然或催促戒断试验） （1）原理：阿片类药物的戒断症状出现后，大鼠体重减轻，但非阿片类镇痛药和镇静催眠药则无明显作用。阿片类戒断后大鼠体重急剧下降，以戒断后24-48h最明显，是考察阿片类身体依赖性的较好指标。 （2）动物：健康大鼠。 （3）实验步骤：自然戒断试验每天早、晚相同时间测定大鼠体重，每次测重后按体重给药，每天2-3次，连续给药数周（不少于4周）。剂量根据LD50和ED50及给药途径制定。原则上低剂量应高于药效学有效剂量，高剂量应尽可能高，但不能出现毒性反应。末次给药后每天测量体重2-3次（与给药次数相同），计算平均值，比较停药前后不同时间的体重变化。催促戒断试验以剂量递增法给药，连续给药1周，末次给药后2h注射拮抗剂，在2h内每隔30min测量体重1次，比较体重下降百分率。也可同时观察大鼠给药后行为变化和体温及自发活动的变化情况，并以第1次给药至反复给药1周内为重要。 （4）结果评价：如戒断后大鼠体重急剧下降，则反应受试物具有身体依赖性。 3、大鼠替代试验（替代试验、交叉躯体依赖性试验） （1）原理：阿片类药物都有基本相同的药理作用，给动物阿片类药物并使之产生身体依赖性后停药，代之以受试物，观察动物是否发生戒断症状。 （2）动物：健康大鼠。 （3）实验步骤：掺食法连续给以吗啡使动物产生身体依赖性，5天后以生理盐水、吗啡或不同剂量受试物代替，每8h给药1次，连续6次。替代前（基础值）及替代后每隔4h测定体重1次，计算各组大鼠的体重变化，比较替代药物组和吗啡依赖组之间的差异。 （4）结果评价：按等效镇痛ED50的倍数计，比较达到同样替代程度的受试药的剂量和吗啡的剂量，可以确定受试药物的身体依赖性潜力的强弱程度。对体内代谢迅速、皮下给药不易形成依赖性的药物，用掺食法诱发依赖性可以获得较明确的结果。 4、大鼠攻击试验（自然或催促戒断试验） （1）原理：大鼠对阿片类药物形成依赖性后停药或用拮抗剂催促，可发生戒断症状，易与同笼大鼠发生相互攻击（一般停药后72h最明显，24h时极不明显；具有间断性的特点，可连续几小时甚至几天）。 （2）动物：健康大鼠。 （3）实验步骤：按递增剂量给药，连续数天，如有依赖性，则停药后大鼠出现体重减轻、摇体、眼睑下垂及扭体等戒断症状；此时如将大鼠同居一笼，则出现嘶叫、对阵和相互攻击现象，甚至受伤致死。一般于停药后第3天进行试验（将动物同居一笼），观察1h，记录对阵时程和嘶叫，以及攻击和互咬次数。 (4)结果评价：本试验可反应吗啡成瘾后脑内多巴胺能神经系统的功能。停药后戒断症状是多巴胺功能亢进的表现，多巴胺受体激动剂可增强攻击反应。所以注意排除药物对多巴胺功能的干扰所产生的假阳性或假阴性。 5、戒断症状的记分评定（自然或催促戒断试验） （1）原理：动物长期获得阿片类药物后，其中枢神经系统能产生一种适应状态，停药或注射拮抗剂后机体出现一系列生理干扰现象即戒断症状。对这些戒断症状的轻重程度进行综合评分即可判断药物的身体依赖性潜力。 （2）动物：常用大鼠和猴。其中阿片类药物在猴上的依赖性表现与人较接近，戒断症状比较明显且易于观察。 （3）实验步骤：按剂量递增法并配合恒量法给药，也可用拮抗剂纳络酮催促戒断。自然戒断或催促戒断后观察一系列戒断症状，根据戒断症状的严重程度和持续时间进行综合评分。 （4）结果评价： 戒断症状的综合评分目前尚无统一标准，可对戒断症状进行全面综合评分，也可对其中主要戒断症状进行综合评分。猴戒断症状可分为轻、中、重、极重4个等级，每一等级的评分可根据症状种类的多少和出现的频率定分，但不能大于级差分值。 依赖性潜力的大小可依据等效依赖性剂量来判断，即产生近似依赖状态的剂量来判定，也可按相同的等效镇痛ED50的倍数剂量来比较。 本方法同时也可进行替代试验。可在自然或催促戒断试验中观察。 附录（二）精神依赖性试验 1、自身给药试验 （1）原理：药物的精神依赖性可产生对该药的渴求，对觅药行为和用药行为具有强化效应。本试验模拟人的行为，通过压杆方式来获得药物，反映药物的强化效应，可信度较高且可进行定量比较。 （2）动物：常用大鼠和猴。 （3）实验步骤： 动物麻醉后无菌条件下行静脉插管并用马甲背心固定，连接弹簧保护套及转轴，弹簧套内硅胶管与插管相连，转轴使动物在笼内能自由活动，转轴另一端与恒速注射泵及储药系统相连。术后常规抗感染，恢复4-7天后进行踏板训练，使动物形成稳定的自身给药行为。试验过程中注意保持套管畅通。如药物具有强化效应，动物经过短期训练后产生稳定的自身给药行为，能自动踩压踏板接通注药装置将药物注入体内。 （4）结果评价： 通过观察是否形成自身给药行为来判断药物是否具有强化效应；由于动物个体差异较大，建议将每只动物自身给药前后踏板次数变化的百分率进行组间统计。 本试验中也可同时进行替代试验。 通过更换受试物的剂量，比较它们在等效ED50倍数剂量条件下的踏板次数或比较产生类似踏板模式的药物剂量，即可反映受试物的精神依赖性的强度。 本试验设计适用于静脉给药，实验中应注意药物稳定性和配药时间的关系。如受试药为口服给药，则不需进行手术，而仅将每次踏板的反应变为给一次口服制剂即可。 2、大鼠药物辨别试验 （1）原理：依赖性药物使人产生的情绪效应如欣快、满足感等，属于主观性效应。具有主观性效应的药物可以控制动物的行为反应，使之产生辨别行为效应。本试验可准确判断受试物是否属于阿片类药物，以及产生精神依赖性潜力大小。 （2）动物：常用大鼠。 （3）实验步骤： 利用辨别试验箱和训练程序训练动物正确压杆，然后通过辨别训练训练动物产生稳定准确地辨别吗啡和生理盐水的能力。最后进行替代试验，以不同剂量吗啡和受试物进行替代，观察压杆正确率与剂量之间的关系，做出剂量-效应曲线，求得药物辨别刺激的半数有效剂量（ED50，值越小精神依赖性潜力越大）。 （4）结果评价： 药物辨别刺激ED50值越小反映精神依赖性潜力越大；如替代药物不产生训练药物反应，则说明该药不属于吗啡类药物。本试验不适用于阿片类拮抗剂。由于药物辨别刺激并非完全基于药物滥用产生，因此在评价药物精神依赖性潜力方面不如自身给药试验可信，但在药物主观效应强度的定量比较方面有其优越性。由于动物训练周期较长（一般3-4个月），试验中要注意耐受性的产生。 3、条件位置偏爱试验 （1）原理：根据巴甫洛夫的条件反射学说，如果把奖赏刺激与某个特定的非奖赏性条件刺激如某特定环境反复练习之后，后者便可获得奖赏特性。反复几次将动物给药后放在一个特定的环境中，如药物具有奖赏效应，则特定环境就会具有了奖赏效应的特性，动物在不给药的情况下依然有对此特定环境的偏爱。 （2）动物：常用雄性大鼠或小鼠。 （3）实验步骤： 试验装置为黑、白两个互通的盒子，中间有可活动的隔板隔开。动物每天上午、下午（或隔天）分别给受试物和生理盐水各一次，给生理盐水后将动物放入一侧盒子，给药后动物放入另一侧盒子，每次在盒中停留30-40min，连续训练5天。第6天在固定时间不给药的情况下将动物放在黑、白盒之间的活动台上，同时用隔板将黑、白盒半隔开。以动物爬到盒底的瞬间开始计时，记录15min内动物分别在两盒内停留的时间。 （4）结果评价： 如果动物在一侧盒子内停留时间显著延长，则表明其对伴药盒产生位置偏爱，该受试物具有偏爱效应。以吗啡为阳性对照药，比较它们在等效ED50倍数剂量条件下的偏爱效应，或比较产生相似位置偏爱效应的药物剂量，即可反映该受试物的精神依赖性潜力的强度。 本试验的准确性取决于训练次数和每天训练的时间。训练次数越多，条件联系越牢固；时间过短则条件联系不牢固，时间过长则离散度增大。 |
