2、体内试验基本要求 2.1 体内试验的给药途径 一般情况下，给药途径应与临床拟用途径一致。若不一致，应说明理由。 2.2 体内检测染色体断裂剂的骨髓试验 啮齿类动物骨髓有核细胞的染色体畸变试验可以检测多种染色体完整性方面的改变，该类变化几乎均来源于原发性的单个或多个染色单体断裂。如果产生了一个无着丝点片段，染色单体或染色体断裂就导致微核形成，因而检测染色体畸变或微核的方法可用于检测断裂剂（注释5）。由于细胞分裂后期的一个或多个染色体相对滞后也能形成微核，因而微核检测方法也能检测一些非整倍体诱导剂（注释6）。 总之，体内骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓嗜多染红细胞微核试验均可用于检测断裂剂。此外也可以通过测定小鼠外周血中未成熟（嗜多染）红细胞的微核率来检测断裂剂，除小鼠外，也可采用其他脾脏无法清除带微核的红细胞或对断裂剂或非整倍体诱导剂有足够灵敏度的动物。 2.3 骨髓微核试验中啮齿类动物性别的选择 对小鼠微核试验检测已知断裂剂的许多研究表明，通常雄性小鼠比雌性小鼠对诱导微核更敏感，二者之间仅有量的差异而无质的差异，但若性别间存在显著的量的差别则会导致性别间的毒性不同。若性别间代谢产物有明显的质的差别，则应采用二种性别的动物。类似的原则同样适用于其他体内试验方法（注释7）。骨髓微核试验可采用小鼠或大鼠。 总之，在微核试验中，除非性别间在毒性或代谢方面有明显差异，一般单用雄性动物即可。如果受试物专用于一种性别，则通常选用相应性别的动物进行试验。 （三）标准试验组合
遗传毒性试验方法有多种，但没有任何单一试验方法能检测出所有的遗传毒性物质，因此，通常采用体外和体内遗传毒性试验组合的方法，以减少遗传毒性物质的假阴性结果。这些试验相互补充，对结果的判断应综合考虑。 1、标准试验组合应具备的特征 标准试验组合应反映不同遗传终点，包括体内和体外试验，从原核到真核细胞，因此应包含以下内容： （1）应包含细菌回复突变试验，因为该试验已被证明能检出相关的遗传学改变和大部分啮齿类动物遗传毒性致癌剂。 （2）因细菌不能完全检测DNA损伤，应采用哺乳动物细胞进行评价。目前使用的几种哺乳动物细胞系有：检测染色体损伤的细胞系（染色体结构和数目畸变的体外试验）；主要检测基因突变的细胞系（注释8）；检测基因突变与染色体断裂作用的细胞系（小鼠淋巴瘤tk试验）（注释9）。现有研究表明，对于检测具有遗传毒性但在细菌回复突变试验中结果为阴性的化合物，在采用合适的试验方案条件下，检测染色体损伤的各种体外试验与小鼠淋巴瘤tk试验结果高度一致。因此，在标准试验组合中，上述试验系统可互相替换。 （3）应包含一项遗传损伤体内试验，以提供一个包括影响受试物遗传毒性作用的其他相关因素（吸收、分布、代谢、排泄）的试验模型。体内试验可另外检出某些遗传毒性物质（注释10）。可采用啮齿类动物造血细胞染色体损伤体内试验或其他合适的体内试验。啮齿类动物染色体损伤体内试验包括骨髓细胞染色体畸变试验和骨髓细胞或外周血红细胞微核试验。 2、推荐的标准试验组合 （1）一项体外细菌基因突变试验； （2）一项采用哺乳动物细胞进行的体外染色体损伤评估试验，或体外小鼠淋巴瘤tk试验； （3）一项采用啮齿类动物造血细胞进行的体内染色体损伤试验。 对于结果为阴性的受试物，完成上述三项试验组合通常可提示其无遗传毒性。对于标准试验组合得到阳性结果的受试物，根据其治疗用途，可能需要进行进一步的试验。 建议采用标准试验组合并不意味着其他遗传毒性试验（如DNA加合物检测，DNA链断裂、DNA修复或重组试验）不合适，这些试验可作为标准试验组合以外的供选试验，以进一步验证或补充标准试验组合得到的遗传毒性试验结果。此外，用分子生物学技术对遗传毒性作用机制进行研究，将有利于危险度评估。在某些情况下，标准试验组合中的一项或多项试验对受试物不适合时，可采用其他替代试验，但应提供充分的科学依据。 标准试验组合不包括为检测非整倍体而设计的特定试验。但是，从体外和体内染色体损伤试验中可得到非整倍体损伤的信息，如有丝分裂指数升高、多倍体产生和微核增加；小鼠淋巴瘤tk试验对于非整倍体诱导剂的检测也能提供一些有用的信息。出现上述情况时可能需要进行进一步的试验。 附录部分简介标准试验组合中常用的几种试验方法，该部分内容只是基本原则，具体试验时需根据具体情况具体分析，设计合适的试验方法。 3、标准试验组合的调整 标准试验组合在一些特殊情况下不适合，需要根据情况进行调整。 （1）在一些情况下，细菌回复突变试验不能提供合适的或足够的信息以评价遗传毒性，如对细菌毒性过大的受试物（如某些抗生素）和可能或已知可干扰哺乳动物细胞复制的受试物（如拓扑异构酶抑制剂、核苷酸同系物或DNA代谢抑制剂）。在这种情况下，体外试验部分可改用二种不同类型细胞和二种不同终点（基因突变和染色体损伤）的体外哺乳动物细胞试验。 （2）三项标准试验组合一般可检出具有遗传毒性作用的可疑结构的受试物（注释11）。但是，对此类结构的受试物，在三项试验组合中的结果为阴性时，需要适当增加一些试验，应根据其化学性质、已知反应性和代谢资料来选择附加试验或调整实验方案。 （3）对于某些特殊的受试物，如毒代或药代动力学研究表明不被全身吸收，在标准体内遗传毒性试验中无法到达靶组织（注释12）的受试物，如放射影像剂、抗酸铝合剂和一些皮肤用药，对这些受试物，标准组合的体内试验难以提供有用的附加信息。若改变给药途径也不能提供足够的靶组织暴露时，可仅根据体外试验进行评价。 （四）与致癌试验相关的附加遗传毒性试验
1、肿瘤产生的相关证据 对于标准遗传毒性组合试验结果为阴性而在致癌试验中出现阳性结果但不能确定具有非遗传毒性作用机制的受试物，建议采用合适模型的附加遗传毒性试验。为了有助于了解作用机制，附加试验可以改变体外试验的代谢活化条件或者进行肿瘤靶器官的遗传损伤的体内试验（例如：肝UDS试验，32P-后标记试验，转基因突变测定，肿瘤相关基因遗传改变的分子特征研究）。 2、具有特异结构的化合物 在极个别情况下，具有特异结构的全新化合物可能会被开发为新药。当不进行该化合物的啮齿类动物长期致癌试验时，应该对其遗传毒性进行深入评估。 |
