注释15：对众多药物进行二室间药物水平的直接比较的研究表明，骨髓是血液灌流性良好的组织，故血液或血浆中药物相关物质的水平与骨髓中水平相似。虽然药物浓度不总是完全一致，但是检测血液或血浆中药物浓度与确定骨髓中暴露水平有足够的相关性。 注释16：在某些情况下，在对所有现有资料进行评估后，证据权衡提示无遗传毒性危害。例如，在体外细胞遗传学试验的一种暴露方案下出现了阳性反应，该阳性结果仅在高剂量时出现，而发生率升高的程度在所用溶剂和细胞系的历史对照数据范围内或刚刚超出该范围。证据权衡后可能提示，虽然染色体异常频率的轻微升高有统计学意义，但无生物学相关性。有帮助的考虑因素包括（1）在出现阳性结果的剂量时细胞毒性的水平；（2）相同试验或补充试验的确证性数据。例如，在无代谢活化下短期暴露时出现阳性结果，但在相当细胞毒性水平的长期暴露中未得到确证，这时阳性结果可能不具有生物学意义。与之类似，在体外染色体畸变试验得到阳性结果，而在相当暴露方案下小鼠淋巴瘤试验未得到确证，也可对该阳性结果的意义产生疑问。如果证据权衡法提示无遗传毒性危害，可进行重复给药的临床试验，该阳性结果应写入研究者手册和知情同意书中。 注释17：一些情况下，体外遗传毒性试验显示出可重复性的阳性结果，而体内骨髓细胞遗传学试验结果经常为阴性，这种差异可能来源于体内外试验生物系统、代谢途径、药物浓度等差异。这种情况下，为确证体外试验阳性结果，进行附加的体内试验很有价值。例如，小鼠重复给药毒性试验中进行外周血涂片可用来评估诱导微核的作用，大鼠或猴重复给药毒性试验进行外周血淋巴细胞培养可用于评估细胞分裂中期的染色体损伤。在潜在的靶组织中应评估DNA损伤（如通过彗星或碱基洗脱试验来评估DNA加合物或DNA链断裂），或用转基因大鼠或小鼠来评估在可能的靶组织中的诱变性。当体外遗传毒性试验结果为阳性时，叙利亚仓鼠胚胎细胞（SHE）转化试验可用作附加试验。一些转基因小鼠也可以在短期致癌性试验中应用，如研究显示p53单一缺陷小鼠可用于致突变性致癌剂的鉴定。 九、附录
推荐的标准试验组合中的遗传毒性试验方法 注：以下方法中所提供的最高浓度和最高剂量设计原则主要针对化学药物，中药、天然药物由于情况复杂，应综合考虑多方面因素，不能简单套用该原则，试验时应根据具体情况进行合理的设计。 （一）细菌回复突变试验（Bacterial
reverse mutation test）
1、菌株 组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和/或色氨酸营养缺陷型埃希氏大肠杆菌，至少应包含下述五种菌株组合（除特殊说明外，均为鼠伤寒沙门氏菌）： （1）TA98；（2）TA100；（3）TA1535；（4）TA1537或TA97或TA 菌株特性鉴定需符合要求， 2、浓度 至少应包含5个可用于结果分析的浓度。 最高浓度主要取决于受试物对细菌的毒性和/或溶解度： a、对于可溶性的无毒受试物，推荐的最高测试浓度一般为5mg/皿； b、对于可溶性的有细菌毒性的受试物，应根据杀菌或抑菌情况确定最高浓度（详见正文 c、对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；若观察到浓度相关性的细胞毒性或诱变性，则要求检测多个产生沉淀的浓度（详见正文 3、代谢活化 一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在S9混合液中的浓度一般为5～30％（v/v）。 4、对照 代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的菌株特异性的阳性致突变剂。 5、方法 可采用标准平板掺入法或预培养法，受试物处理后48～72小时观察结果。每一浓度至少平行三皿。实验至少重复一次。 6、结果判定 结果中应描述各浓度组细菌毒性大小和沉淀情况，结果表示为每皿的回复突变菌落数，并计算各组的均值和标准差。 至少在一个菌株上，在有或无代谢活化的情况下，受试物所诱发的回复突变菌落数出现浓度依赖性的增加和/或在一个或多个浓度组上出现可重复性的增加，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学方法有助于对结果的评价，但是统计学意义不是阳性反应的唯一标准。 （二）体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（In vitro Mammalian
chromosomal aberration test）
1、细胞 可采用哺乳动物或人的细胞进行试验，如CHL细胞、CHO细胞、人外周血淋巴细胞等，细胞系需定期检查核型和有无支原体污染等。 2、浓度 至少应包含3个可用于结果分析的浓度。 最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性和/或溶解度，中、低浓度一般采用倍比稀释法： a、对于可溶性的无毒受试物，推荐的最高测试浓度一般为5mg/ml或 b、对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度，如通过活细胞计数、细胞融合率或有丝分裂指数等确定，一般毒性应大于50％（详见正文 c、对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；若观察到浓度相关性的细胞毒性或诱变性，则要求检测多个产生沉淀的浓度（详见正文 3、代谢活化 一般采用诱导剂，如Aroclor 1254或苯巴比妥和β-萘黄酮联合诱导处理后的哺乳动物肝脏微粒体酶（S9）进行体外代谢活化试验，即在加S9和不加S9平行条件下测试。S9在试验介质中的终浓度一般为1～10％（v/v）。 4、对照 代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性（空白对照和/或溶剂对照）和阳性对照组。阳性对照物应为已知的阳性致突变剂。 5、方法 处理及细胞收获时间：在代谢或非代谢活化的情况下，受试物和细胞作用3～6小时，在1.5个细胞周期时收获细胞。若均得到阴性结果，需在非代谢活化条件下，受试物和细胞应持续作用至1.5个细胞周期时收获细胞。对某些受试物与细胞接触时间/收获细胞时间可能要大于1.5个细胞周期。 读片分析：一般油镜下每种浓度至少观察200个分散良好的中期分裂相细胞，若观察到大量染色体畸变细胞，分析细胞数可相应减少。应分别记录各组含有结构畸变染色体的细胞数和畸变类型，裂隙应单独记录，但不计入畸变率中。同时应单独记录多倍体和内复制等数目畸变，但不计入畸变率中。 6、结果判定 结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况，结果表示为染色体结构畸变细胞的百分率。 受试物所诱发的染色体畸变率出现浓度依赖性的增加，或出现可重复性的增加，可判定为阳性结果。结果判定时应首先考虑试验结果的生物学意义，统计学方法有助于对结果的评价，但是统计学意义不是阳性反应的唯一标准。 多倍体数目的增加提示受试物可能会抑制有丝分裂或诱导染色体数目畸变。出现染色体内复制的细胞数增多提示受试物可能会影响细胞周期。 |
