血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则

  （三）观察指标
  1．病毒方面
  （1）去除/灭活病毒滴度；
  （2）灭活病毒速率、灭活曲线。以列表和做图形式报告验证结果。

   2．病毒去除/灭活各参数允许变化范围

  3．蛋白质方面
  （1）制品质量应符合《中国生物制品规程》或有关规定；

  （2）采用适当方法测定蛋白质结构和功能活性的变化。如：制品比活性、IVIG的Fc功能分析可了解蛋白质结构是否发生了变化；凝胶色谱法可检测蛋白质分子大小和形状的变化；蛋白质形状变化可导致扩散系数、沉降常数和粘度的改变；SDS-PAGE，特别是等电聚焦和PAGE结合（双向电泳）也是检测蛋白质结构变化的很好方法。

  （3）如果采用新的去除/灭活方法（包括更换使用已认可的病毒灭活方法或国内外未曾采用过的病毒去除/灭活方法），需对蛋白质半衰期和新免疫原性进行研究。要求如下：
  半衰期：用适宜动物（如大鼠或家兔）和未经病毒去除/灭活的相同制品进行半衰期比较；
  新免疫原性：新免疫原性用来检查蛋白质较高级别结构上的变化。这些变化不一定损害蛋白质功能，但是会引起受体免疫反应。实验室检测新免疫原性是非常困难的。可用经和未经病毒灭活的蛋白分别免疫动物（如家兔），所产生的抗体交叉用未经和经病毒灭活的蛋白结合。如果经病毒灭活的蛋白抗体被未经病毒灭活的蛋白完全结合，说明不含新抗原。由于不能保证人类免疫系统识别的表位与实验动物相同，因此推荐在Ⅳ期临床（获得生产文号后）开展是否有新抗原产生的研究。

  （四）效果的判定
  判断病毒去除/灭活的有效性须综合考虑，不能仅以病毒去除/灭活的量来确定。在确定有效之前，必须考虑如下因素，审慎评价每次验证结果。
  1．验证试验所选择的病毒是否适宜，病毒验证的设计是否合理。

  2．病毒降低量（log10）≥4 logs，表示该步骤去除/灭活病毒有效。如因检测方法造成病毒降低量＜4 logs时，应盲传三代，如无病毒检出，可认定是有效的灭活病毒方法。

  3．病毒灭活动力学可更好的显示病毒灭活的效果。病毒灭活通常不是简单的一级反应。往往是起始反应速率快，其后变慢。如果病毒灭活速率随时间明显降低，表示该方法可能无效，或者残留的指示病毒对该灭活方法有抵抗力，说明该步病毒灭活方法无效。

  4．病毒实际滴度为基础病毒，指示病毒与样品1:9的比例混匀后零点取样的病毒滴度，通过与经去除/灭活病毒后的测定的实际病毒残留量的比较，作为该病毒去除/灭活方法（步骤）实际的灭活病毒的量。

  5．病毒检测敏感度的限值。
  举例说明：
  （1）加入6 logs 病毒，剩余4 logs 病毒，可将去除/灭活病毒的log数计算在生产全
过程中去除/灭活病毒总量之中，但是就此步（方法）去除/灭活病毒能力而言是无效的。
  （2）加入6 logs 病毒，但由于制品本身的细胞毒作用使得检测灵敏度限值为4 logs ，
仅证明除去2 logs 的病毒。在此种情况下需改变试验设计重新进行验证。
  （3）加入6 logs 病毒，但仍可测定2 logs 的剩余病毒，且清除病毒的量可重复出，并不受工艺的影响，应认为是有效的去除/灭活病毒的方法。
  （4）加入 6 logs病毒 ，之后未检测出病毒。但是由于检测灵敏度限值为2 logs ，仅能认为大约清除或灭活了4 logs 病毒。事实上可能等于或大于4 logs ，因此应判定此方法清除的病毒量≥4 logs。
  （5）病毒灭活动力学是非常重要的观察指标。如巴氏消毒法（60℃，10小时），如果病毒残留量很快降到最低检出限度值，说明此方法灭活病毒效果很好。如果病毒灭活速率缓慢，在灭活结束时才达到最低检出限度值，不能认为是一个有效的病毒灭活方法。这就是说，评价验证结果不能仅考虑病毒降低量，同时也要考虑病毒灭活动力学。

四、生产工艺去除/灭活病毒能力的验证
  生产工艺去除/灭活病毒能力验证参照特定的去除/灭活病毒方法验证的要求进行。需要特殊考虑的问题有以下几方面：
  （一）只对可能有去除/灭活病毒作用的生产步骤进行验证。

  （二）模拟的生产工艺各种参数应尽可能与实际的生产工艺相一致，如pH、温度、蛋白质和其他组成成分的浓度、反应时间、层析柱的柱床高度及流速与床高的比例、洗脱图谱及该步骤的生产效果（如产量、比活性、组成成分）。应分析生产工艺中各种参数的偏差对病毒去除/灭活效果的影响。

  （三）生产各步骤对不同类型病毒去除/灭活的选择性。

  （四）核酸扩增技术（如PCR）检测病毒核酸的灵敏度比较高，但是该检测技术最大
的局限性是不能区别被灭活了还是未被灭活的病毒。因此该技术不能用于灭活病毒量的验证，只能用于生产过程中病毒去除量的验证。

  （五）通常在生产过程中去除/灭活病毒量是可以计算在清除病毒总量中，但不能认定是有效病毒去除步骤。因为生产过程通常有一些变化，很难控制及验证，而且，病毒分配完全取决于病毒特异的理化性质，这些理化性质影响了病毒与凝胶介质相互作用和沉淀的性质。因此由于病毒表面特性的微小差异（如：糖基化），指示病毒与靶病毒分配形式可能完全不同。在实验室增殖的相关病毒可能在分配上与野生株不同。然而，如果病毒降低量可重复，如果影响病毒分配的各生产参数可以适当地确定和控制，所要的组份能可靠的与一般公认的含病毒组份分开，就可以符合有效步骤的标准（即，认为是有效去除/灭活病毒步骤）。

  （六）验证的目的是为了确定生产工艺去除/灭活病毒的能力，获得生产全过程中估计去除/灭活病毒的总量。一般降低的总量是各步降低病毒量的总和。但是由于病毒验证的局限性，如分步骤中病毒降低量≤1 log则不应将其计算在总量中。

五、去除/灭活病毒方法的再验证
  以下几种情况需进行病毒去除/灭活方法的再验证：
  （一）首次生产者，需对生产工艺中特定的去除/灭活病毒方法进行再验证；

  （二）采用新工艺或对原有生产工艺进行了重大改革时，需对生产工艺进行清除病毒
能力验证；对特定的去除/灭活病毒方法进行去除/灭活病毒效果验证；

  （三）工艺改变但不属重大工艺改革时，需对特定的去除/灭活病毒方法进行再验证；

  （四）被灭活的中间品组成成分或pH值发生改变时，需对特定的去除/灭活病毒方法进行再验证。