3、指示病毒的选择 可以从以下方面考虑： 1）一个典型的验证研究所选择的病毒，至少应包括单链和双链的 RNA 及 DNA、脂包膜和非脂包膜、强和弱抵抗力、大和小颗粒等病毒；去除/灭活技术方面可根据采用的具体方法选择恰当的适宜病毒，例如 SD 法可选用脂包膜病毒，膜过滤法可选用粒径小的病毒，加热法可选用脂包膜和非脂包膜病毒，低 pH 孵放法可选用对理化因素比较耐受的指示病毒等。 2）应尽可能选择可培养至高滴度的病毒，对每一种指示病毒，都应提供可靠的检测方法。 3）应注意选择的指示病毒可能对验证操作人员形成的健康危害，并采取必要的防护措施，遵守国家有关的管理规定，属于烈性传染病毒不能使用。 总之，应以生物组织原材料、种子细胞或者组织原材料匀浆、培养细胞结束时的混悬液中可能出现的污染病毒为核心，结合能够用于评价验证效果的指示病毒的可获得性与相关培养试验条件进行合理选择。 4、人员、设施 应参照 GMP 的相关要求。验证研究应当在单独的实验室进行，应当配备适于开展病毒研究工作的相应试验条件和设备，试验人员应当具有必要的病毒学试验专长和技能，在实验病毒学专家的指导下设计和准备模拟的生产工艺。 （二）、病毒去除/灭活有效工艺步骤评价 生产工艺过程对不同种类的病毒的去除/灭活机制可能有所不同，因此在对去除/灭活资料分析总结时应当综合考虑各种因素，确定对病毒的去除/灭活效果。 1、评价基本要点 主要考虑病毒载量下降的程度和动态过程两个方面。 1.1 病毒载量下降的程度 一般将病毒感染性滴度减少≥4log 的处理步骤认可为有效的病毒去除/灭活工艺步骤。病毒感染量的降低可以从病毒颗粒去除或者被灭活的情况两方面来评价。对于有效的具体工艺步骤，应注意区别灭活作用与去除作用。当在多个层析步骤中均使用了相同的缓冲液时，由于该缓冲液在洗脱过程中很可能对病毒发挥了直接的灭活作用，显然不能将这一作用归结于每个层析步骤起到了各自的去除作用。 1.2 病毒去除/灭活动态分析 病毒的去除/灭活过程不是简单的一级动力学反应过程，病毒感染活性一般先经过快速下降期，然后转入缓慢下降期的双时相特征。如果病毒逃逸了第一个灭活步骤，则在随后的步骤中可能会增加抵抗力。如果病毒逃逸的原因是由于形成了聚集颗粒，则在后续步骤中，很可能对许多理化处理因素或者加热过程不再敏感。病毒的灭活具有时间依赖性，因此加入了指示病毒的中间产品，应在特定的缓冲液或层析柱中保留足够的时间，以充分模拟将来的实际工艺过程及条件。在去除/灭活研究中应设立合理的取样时间，通过在不同的适宜时间多次取样，绘制出病毒去除/灭活过程的动态变化图。选择的取样点应包括能够完全去除/灭活病毒的最小处理时间点以及在最小处理时间点以外的其它代表性时间点。 2、影响因素及综合分析 在设计和执行试验研究的过程中，应充分重视和考虑干扰病毒去除/灭活效果的实际影响因素，增加安全性评价的客观性和准确性。 2.1 指示病毒和加入方式 经组织培养方法制备的指示病毒，其性质、特点及行为可能发生了适应性改变，与工艺过程中实际遇到的自然状态下的病毒有所不同，例如培养的病毒与自然增殖的病毒在均一性和积聚特性方面不完全相同。在制备高滴度的感染性病毒时，应避免病毒颗粒的聚集，以防止高估物理去除/灭活方法对降低病毒感染量的实际作用；应尽可能将指示病毒以较小的体积加入待测产品中，以免加入病毒引起稀释效应或者改变产品的性质；由稀释样本获得的检测结果，可能与将来实际生产中产品的结果并非完全相同。应注意任何微小的改变例如缓冲液、培养基或试剂等可能对去除/灭活效果产生的影响。 2.2 工艺总体去除/灭活效果 一个有效的工艺步骤实际上应当在两个独立的验证研究中都能够重复出相同的病毒去除/灭活量。生产工艺对病毒的总去除/灭活效果应为各步骤去除/灭活效果之和。在适宜的控制条件下，经恰当设计的工艺过程例如柱层析、膜过滤及纯化步骤等，均有可能成为有效的病毒去除步骤。如果去除效果仅够一个对数级甚至低于一个对数级，通常可忽略其效果，不记入工艺总的去除指数内。如果各工艺步骤几乎没有降低感染量的作用，则必须引进有效的去除和/或灭活步骤。病毒去除/灭活的效果应超过病毒潜在的污染负荷。 在分析试验结果时，对于重复使用同样或类似的缓冲液及层析柱，一般不应累加其指数，除非能提供充足的依据和理由，如果将多步骤的去除/灭活指数相加（特别是将灭活效果不明显的步骤相加）或者将工艺过程中重复采用的同样或者类似灭活机制形成的灭活效果累加，可能会高估工艺实际能达到的效能。应注意有效步骤对病毒的去除/灭活效果可能与实际生产工艺中使用的效果有一定偏差。 2.3 检测方法评价 如果生产条件或者缓冲液的细胞毒性或者杀病毒作用过强，则验证研究有可能从整体上低估工艺对病毒的灭活作用，当然也可能由于病毒去除/灭活验证研究本身的局限性和试验设计不充分等方面的原因而过高估计了去除/灭活效果。应分别单独评价缓冲液和制品在病毒滴度检测方法中的毒性和干扰作用。如果样本溶液对细胞有毒性，应对含有负载病毒的缓冲液进行适宜的稀释、调整pH或者透析，如果样本本身含有抗病毒的活性成分，则应采用不含该活性成分的模拟溶液进行验证研究。但应考虑不含有抗病毒成分的溶液（比如以其它类似成分代替的溶液）可能会改变某些工艺步骤中病毒的行为。应设立充分的平行对照试验，说明试验本身及样本制备过程，提供相关的试验资料，以排除由于样本的透析、稀释、浓缩、过滤及贮藏可能对去除/灭活验证效果的影响。可使用感染性滴度测定方法或者透射电镜的方法确定样本中的病毒量，考虑检测方法的定量分析灵敏度、最低检测限。如果检测方法的最低检测限为103TCID50，即使病毒启始滴度为 106TCID50，经处理后未检出病毒，也不宜算作特定的有效工艺步骤，因为经处理后病毒的残留量有可能大于 102TCID50，因此只能根据检测方法的灵敏度表示为未检出。 2.4 互补的去除/灭活步骤 模拟工艺过程的研究结果与实际生产工艺总会有所区别。即使充分考虑各种影响因素，也只是模拟实际中可能发生的结果，两者之间难以进行完全替代。为达到有效的去除/灭活效果，通常须联合使用灭活与去除步骤，甚至多个从机制上能够互补的去除和/或灭活步骤。 （三）、统计处理分析 病毒去除/灭活验证研究中，应进行适宜的统计处理分析，特别是有关病毒量的正确估算，以支持得出的结论。
五、病毒安全性的追踪观察 药品临床研究和上市后追踪观察，对于确认其病毒安全性具有直接的证明作用。因此对动物组织细胞来源的生物制品，在临床研究及上市后应进行必要的病毒安全性追踪观察。针对可能污染的病毒，注意观察并设立病毒感染的评价指标，包括已知对原材料来源动物有致病性的病毒，在体内、体外试验中能够感染人类组织细胞的病毒，特别是隐性感染的病毒。通过血清学或者培养分离等临床检测，发现和验证在生产过程中未能检出的新病毒及感染特征。采用的检测方法应当能够鉴别出人与动物病毒的区别，并经过验证确保敏感性和特异性。 |
