2.生物学确认 湿热灭菌工艺的微生物挑战试验是指将一定量已知 DT 值的耐热芽孢（生物指示剂）在设定的湿热灭菌条件下进行灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能使产品达到预定的无菌保证水平。生物指示剂被杀灭的程度，是评价一个灭菌程序有效性的直观指标。 2.1 生物指示剂选用的一般原则 生物指示剂的选用参照《中国药典》2020 年版四部通则9207“灭菌用生物指示剂指导原则”。针对具体的灭菌工艺和具体的产品，还应注意所用的生物指示剂的耐受性应强于待灭菌产品中的污染菌。 湿热灭菌工艺常用的生物指示剂有以下几种，嗜热脂肪地芽孢杆菌，生孢梭菌、枯草芽孢杆菌等。对于采用过度杀灭法的灭菌程序，生物指示剂系统主要是嗜热脂肪地芽孢杆菌的芽孢，或其他 D121°C 值大于 1 分钟的芽孢。残存概率法由于其热输入量比较低，因此在验证中使用的生物指示剂的耐受性可以小于嗜热脂肪地芽孢杆菌。 2.2 生物指示剂的使用和放置 实际验证过程中可以将生物指示剂接种到待灭菌产品中或直接使用市售的生物指示剂成品。由于生物指示剂在不同介质或环境中的耐受性会有所不同，所以无论是将生物指示剂接种到待灭菌产品的方法，或直接使用市售的生物指示剂成品，均应考虑待灭菌产品对细菌芽孢耐受性的影响，如果待灭菌产品会使芽孢的耐受性增加，应采用直接接种到待灭菌产品的方法。 如果生物指示剂与产品不相容，可以用与产品相似的溶液来代替产品。使用市售生物指示剂时，应确保生物指示剂的 DT值和总芽孢数等主要质量参数的准确性。 生物指示剂的接种量（即初始芽孢数）需要根据生物指示剂在待灭菌样品中的耐受性和灭菌工艺条件来确定，应符合挑战性试验的要求。生物指示剂的接种量可用附件 2 的方法计算。 生物指示剂的数量和放置位置应综合灭菌器的几何形状、空腔尺寸、产品的装载方式以及热分布确认的结果等要素确定，且在灭菌设备的冷点处必需放置生物指示剂。装有生物指示剂的容器应紧邻于装有测温探头的容器，直接接种供试品宜放置在热穿透试验产品的紧邻位置，灭菌器的其他部位应装载产品或者类似物，以尽可能的模仿实际生产时的状况。 2.3 灭菌 生物指示剂挑战试验应该按照产品设定的灭菌工艺进行灭菌。每个产品的每一灭菌程序，至少需要连续进行三次生物指示剂挑战试验。 2.4 检查和培养 可以根据生物指示剂的生长特性以及验证时的接种方式，采用适当的方法进行检查和培养。完成灭菌后，尽快将挑战指示剂放入培养基中进行培养。需要注意不同的生物指示剂所需要的培养条件也各不相同，建议参照所用生物指示剂的特性和供应商的说明书来选择培养条件，同时应放置阳性对照品和阴性对照品。 2.5 试验结果的评价 根据生物指示剂的 DT 值、接种量以及挑战试验验证结果，结合产品灭菌前微生物的污染水平（耐受性及微生物污染数量）来评价产品在验证的灭菌条件下实际达到的 SAL 值。如果验证结果出现不合格，需要分析原因，采取相应的改进措施后重新进行验证工作。 3.基于风险评估的验证方案设计 湿热灭菌工艺验证时，如存在不同灭菌器（一般指相同工作和设计原理的灭菌器）、处方组成、容器规格、装量、装载方式等情况。在不牺牲无菌保证水平的前提下，为减少验证试验数量，降低验证成本，可综合各方面因素考虑，在风险评估的基础上，通过充分的合理性论证，选用具有代表性的灭菌器、待灭菌产品和装载方式等进行灭菌工艺验证，可不必对所有情况进行验证。
三、注射剂无菌生产工艺 注射剂应首选终端灭菌工艺。如经充分的研究（包括处方工艺研究、质量控制研究等）证实产品无法耐受终端灭菌工艺，则可考虑能否通过除菌过滤工艺进行过滤除菌，如果可以，可采用包含除菌过滤的无菌工艺；如果不可以，则可考虑采用无菌分装的全无菌工艺。 （一）无菌生产工艺的研究 1.除菌过滤工艺的研究 除菌过滤是指采用物理截留的方法去除液体中的微生物，以达到无菌药品相关质量要求的过程。采用除菌过滤工艺时，工艺研究和生产过程控制的重点是影响无菌保证水平的工艺步骤和工艺参数，主要包括物料（如原料药、辅料、内包装材料等）的质量控制、除菌过滤系统的设计及选择、除菌过滤工艺参数的研究、除菌过滤生产过程的控制等。 通常，除菌级过滤器在工艺条件下每平方厘米有效过滤面积可以截留≥107CFU（colony forming unit，集落/菌落形成单位）的缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta，曾用名：缺陷假单胞菌）。除菌过滤工艺通常选用 0.22μm（更小孔径或相同过滤效力）的除菌级过滤器。 应尽可能采取措施降低除菌过滤的风险，例如：①宜安装第二只已灭菌的除菌过滤器，最终的除菌过滤器应当尽可能接近灌装点；②由于微生物通过除菌过滤器的概率随着待过滤药液中微生物数量的增加而增加，最终除菌过滤前，待过滤药液的微生物负荷一般小于等于 10cfu/100ml；③应通过研究确定药液配制后至过滤前的存放时间、药液过滤操作的时间、过滤后至灌装前放置的时间等工艺时限。 除菌过滤器的除菌过滤效能是评价除菌过滤工艺的重要参数，需要进行相应的研究和验证。通常，影响除菌过滤器的除菌过滤效能的因素包括：①药液的性质，如药液的粘度、表面张力、pH 值、渗透压等；②过滤步骤的工艺参数，如过滤的压力、流速、时间、温度等；③除菌过滤器与所过滤的药液的相互作用，如除菌过滤器与药液的相容性；④除菌过滤器预处理、过滤总量和使用周期等。除菌过滤器的过滤效能可因产品和操作条件不同而不同，滤器的选择及工艺参数的研究应考虑上述因素。 2.无菌分装工艺的研究 无菌分装工艺是指灭菌/除菌工艺处理后的原料药或者原料药和辅料，用无菌操作的方法分装到灭菌后的容器中再进行密封的生产工艺。无菌分装工艺的工艺研究和生产过程控制的重点同样是影响无菌保证水平的工艺步骤，主要包括物料（原料药、辅料、内包装材料等）的质量控制、物料暴露于环境中可能再污染的操作步骤等。 关于物料的质量控制，采用无菌分装工艺的制剂所涉及的所有物料，都必须采用适当的灭菌/除菌工艺处理后方可使用。各物料的灭菌/除菌工艺，都应经过验证、进行监测，并受到良好的控制。同时需要对各物料的无菌性、细菌内毒素水平等进行严格控制，通过研究确定相应的质控标准。 原料药或者原料药和辅料的分装步骤是影响产品质量和无菌保证水平的关键生产步骤，应结合生产设备和产品特点进行工艺参数（如分装速度和分装时间等）的研究，并确定相应的工艺控制标准。 （二）无菌生产工艺的验证 无菌生产工艺验证主要包括除菌过滤工艺验证及无菌工艺模拟试验。采用除菌过滤工艺的产品应进行除菌过滤工艺验证及无菌工艺模拟试验，采用无菌分装工艺的产品应进行无菌工艺模拟试验。 1.除菌过滤工艺验证 除菌过滤工艺验证一般包括细菌截留试验、化学兼容性试验、可提取物或浸出物试验、安全性评估和吸附评估等内容。应结合产品特点及实际过滤工艺中的最差条件，对相关验证试验进行合理设计，具体验证操作（如细菌截留试验中挑战用微生物的选择、滤膜的要求，可提取物和浸出物试验中的风险评估、提取方式、检测方法及安全性评估，化学兼容性试验中应重点考察的指标，吸附试验的试验条件等）可参照《除菌过滤技术及应用指南》及《化学药品注射剂生产所用的塑料组件系统相容性研究技术指南》相关内容进行。其中，结合产品特点，还应关注的内容如下：
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