抗病毒药物病毒学研究申报资料要求的指导原则(国食药监注[2012]122号) ... ... ...

药物的有效浓度是指使病毒复制的水平降低50%的浓度（细胞培养试验中用EC₅₀表示，生物化学或亚细胞试验中用IC₅₀表示）。评价药物的抗病毒活性和细胞毒性的方法包括但不局限于病毒灭活试验、空斑减数试验、细胞病变效应抑制试验、病毒抗原或核酸检测、感染性病毒颗粒检测、含报告基因的病毒或细胞检测等。可能影响这些试验的因素包括病毒感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）和给药时间（如病毒感染前给药或感染后不同时间给药）。建议申请人使用传代次数较少的宿主细胞进行研究。

    药物的有效浓度与作用机制研究的数据应一致，如果药物抑制病毒复制所需的浓度低于根据假定的作用机制计算出的生化数据，则提示可能还存在其他的作用位点或机制。当抗病毒活性数据与生化数据不一致时，可以通过耐药性分析证明药物在体内的作用机制。对于核苷或核苷酸类似物，建议在细胞的稳定期及分裂期测定药物活性分子的三磷酸盐的半衰期（t_1/2）。

    某些影响人类健康的病毒（如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等）目前尚无合适的细胞培养系统或动物模型。对于此类病毒，可以通过对亲缘关系很近的病毒关键功能和活性的抑制揭示药物的潜在抗病毒活性。如果目标病毒目前尚无合适的细胞培养系统或动物模型，而且药物的作用部位被认为位于细胞内、细胞内的药物浓度与生化研究中的结果一致时，确定抗病毒药物的活性部分能否进入细胞内尤为重要。目前用于研究乙型肝炎病毒（HBV）的细胞系和基于细胞的检测方法还非常有限。研究丙型肝炎病毒（HCV）进入、复制和感染的基于细胞的试验取得了一定进展，但还存在很多不足。

    目前用于检测HBV复制的方法包括但不限于：

l  通过生物化学试验测定HBV DNA聚合酶的活性。

l  使用杆状病毒介导的转入或转染HBV基因组到人肝细胞株进行细胞培养试验，然后用HBV DNA探针经Southern Blot定量分析检测HBV cccDNA及RI-DNA等的形成。

l  用含有HBV基因组（复制可调控或不可调控）的稳定转染细胞株进行细胞培养试验。

l  采用定量PCR法测量细胞外的HBV DNA。

    对于HCV,目前有用于研究病毒进入（或受体）的假病毒系统（HCVpp）、研究病毒复制的复制子系统（Replicon）以及研究完整病毒复制周期的病毒感染系统（HCVcc），这些系统均可用于评价药物对HCV的抗病毒活性。遗憾的是HCVcc系统目前仅在2a亚型中取得成功。目前用于评价药物抗HCV活性的方法包括但不局限于：

l  体外检测药物对病毒靶标蛋白（HCV RNA聚合酶、HCV丝氨酸蛋白酶）的抑制活性。

l  采用不同亚型复制子系统评价药物对不同亚型HCV复制的抑制作用。通过报告基因检测病毒抗原的表达水平，或通过RT-PCR检测HCV复制子细胞中HCV RNA的水平。

l  在HCVcc系统中，通过检测病毒中报告基因编码产物（如荧光素酶或绿色荧光蛋白等）的活性反映药物对病毒的抑制作用。也可以通过RT-PCR检测HCV复制子细胞中HCV RNA的拷贝数，或定量检测病毒抗原水平。

2.血清蛋白存在条件下的体外抗病毒活性

血清蛋白能与许多药物结合或螯合，从而影响药物的抗病毒活性。建议申请人详细考察药物是否能与血清蛋白显著结合。测定药物血清蛋白结合率的常用方法包括平衡透析法、超滤法以及基于荧光技术的高通量人血清白蛋白和α-酸性糖蛋白结合试验。如果药物的蛋白结合率较高，则建议申请人在加入系列人血清稀释液（如5%、10%、20%、40%）条件下测定药物的体外抗病毒活性。通过这些数据可以推算出药物在100%人血清中的EC₅₀，同时应报告血清校正后的EC₅₀值。此外，建议申请人在含有生理浓度的α-酸性糖蛋白和人血清白蛋白的条件下测定药物的EC₅₀值。

3.抑制指数

血浆药物浓度和细胞内药物浓度对于评价抗病毒治疗的量效关系和发生耐药的可能性非常重要，计算抑制指数（Inhibitory Quotient，IQ）时也需要用到这些数据。抑制指数（IQ）等于C_min除以血清校正后的EC₅₀值。测定EC₅₀值的更多信息可参阅第三部分（二）第1节-体外抗病毒活性。IQ值是一个综合药物的体内浓度和抗病毒活性的有用工具，也是描述药物的暴露程度与病毒对药物敏感性之间相互关系的一个指标。如果一种药物的IQ较高，则表明患者体内的药物能达到有效抑制病毒的浓度，可使耐药发生的概率降到最低。由于同一种剂量可能并不适用于所有的患者，所以IQ值也可以用于指导III期和IV期临床试验剂量的选择。

4.体内抗病毒活性

    在体外抗病毒活性研究的基础上，可进一步通过动物感染模型来评价药物的抗病毒活性。动物模型的分析指标包括病毒感染后（需要有证据证明）动物发病率和死亡率、组织学检查、各时间点的病毒载量、在发生病毒反弹的动物体内耐药株的分离和鉴定、病毒抗原和抗体的定量检测、药代动力学数据以及症状（如神经系统症状、体重减少等）。

（三）细胞毒性及治疗指数

    申请人应在临床试验前开展药物细胞毒性和治疗指数的研究。需要证明药物在体内可达到的浓度下具有抗病毒活性，同时该浓度的药物不会对细胞产生毒性作用。应排除测定的药物抗病毒活性是由于宿主细胞死亡所造成的可能。这一点非常重要。

在细胞毒性试验中，应设置抗病毒药物的浓度梯度，测定导致50%的宿主细胞死亡的浓度[参见第三部分（二）第1节-体外抗病毒活性]，即所研究药物的半数细胞毒性浓度，通常用CC50或CCIC50来表示。治疗指数或选择性指数（即CC50/EC50）则是药物的细胞毒性效应与抑制病毒复制效应的比值。理想的药物应具有最大的抗病毒活性，同时具有最小的细胞毒性（即具有较大的治疗指数）。

建议申请人对处于稳定期和分裂期的各种类型的、相关的人细胞和组织细胞进行CC50值的测定，确定药物对不同细胞周期、不同细胞类型或不同组织的潜在毒性。

    由于某些抗病毒药物对骨髓有抑制作用，建议申请人采用细胞集落形成法评价某些药物（如核苷类似物）对人骨髓祖细胞生长的潜在影响。此外，某些药物也对负责正常细胞核DNA和线粒体DNA合成及修复的细胞DNA聚合酶具有潜在的抑制作用。申请人应测定抗病毒药物对细胞聚合酶的IC50，同时应证明药物对病毒靶点作用的特异性（与对细胞聚合酶的作用相比）。人体的DNA聚合酶γ负责线粒体DNA合成，人DNA聚合酶γ被抑制与线粒体功能缺损之间具有相关性，并会导致人体不良反应的发生。因此，考察某些药物（如核苷类似物）对人聚合酶γ活性的影响以及对线粒体的毒性作用（如乳酸的生成量，线粒体DNA含量、线粒体形态学，葡萄糖利用率）就显得非常重要。

（四）体外联合用药的活性分析

    感染病毒的患者体内可能存在不同的病毒变异株，其中某些类型的病毒株可能对一种或多种抗病毒药物具有耐药性。因此，对于某些病毒而言，同时给予多种抗病毒药物（如抗HIV-1的联合药物疗法）可能会比使用单一的药物产生并维持更好的抗病毒作用。但是不同药物之间的相互作用比较复杂，联合用药后可能导致药物的抗病毒活性出现相互拮抗、相加或者协同等作用。因此，申请人应在体外试验中评价药物与其他已上市的、治疗相同疾病药物之间联合用药的抗病毒活性。具体来说，应评价所研究药物与所有已上市的针对相同靶点的药物之间联合用药的抗病毒活性，对于已上市的治疗相同适应症的不同靶点的药物，应选择两种或两种以上进行此类研究。

建议申请人在开始评价联合用药疗效的临床试验前，先完成体外联合用药的活性研究。有时患者会混合感染两种或两种以上的病毒（如：HIV与HBV或HCV共感染），因此，体外联合用药活性试验还应考察治疗同时感染不同种类病毒的药物与所研究药物合用的体外抗病毒活性。