（五）耐药性 1.体外耐药病毒株的选择
本指导原则主要关注病毒基因突变导致的病毒对特定的抗病毒药物的表型敏感性降低的耐药性。这里所说的耐药性并不是绝对耐药，而是一个相对的概念。建议在开始以感染特定病毒的患者为对象的临床试验前，先通过体外试验选择对药物耐药的病毒株，鉴定耐药株的表型和基因型，并进行交叉耐药性分析。尽管通过体外试验获得的耐药性数据可能并不能准确预测临床耐药性，但仍建议申请人通过体外耐药株选择试验评价目标病毒对药物产生耐药性的屏障，从而有助于临床试验的设计。 通过在细胞培养中选择对药物耐药的病毒株，可以了解耐药性产生遗传阈值的高低。遗传阈值低的药物可以选择仅含1或2个突变位点的耐药株。而遗传阈值较高的药物则可能在病毒株中发生多处突变才产生耐药性。药物和目标病毒的许多因素可对耐药性产生影响，如药物浓度。突变株的出现速率取决于病毒复制速率、产生的病毒基因组的数量、复制机制的保真度以及宿主因素。对这些因素的了解有助于设计检测耐药株的体外试验。例如，如果需要发生多个突变方可对药物产生耐药性，则许多细胞培养系统提供的病毒滴度可能不足以用于选择耐药病毒。遇到这种情况时，可以在逐渐增加药物浓度的条件下使病毒在细胞培养中连续传代，这样可能会选择出耐药株。在评价耐药性的体外试验中，药物的浓度范围应覆盖其在人体内的预期浓度。选择对药物耐药的突变毒株的试验应在下列条件下重复进行：使用不同的野生株、使用不同的耐药株、高选择压力及低选择压力等，并确定不同的试验中产生的耐药性突变的类型是否相同，以评价药物浓度与耐药性遗传屏障之间的关系。 当采用细胞培养系统复制目标病毒时，可以采用下列两种基本方法选择对药物敏感性降低的病毒株： l
病毒以较高的MOI接种宿主细胞，在多种固定的药物浓度下分别连续传代，诱导耐药株的产生。 l
病毒以较低的MOI接种宿主细胞，病毒传代期间逐渐增加药物浓度，起始药物浓度接近药物对亲代病毒的EC50。 采用合适的方法对病毒的复制进行监测，通过对选择期间分离株的基因型和表型的鉴定，检测耐药毒株的产生。 HCV对药物的耐药性可以通过HCV复制子系统进行考察。使用HCV复制子细胞筛选HCV耐药性的方法包括下列几种： l
在含新霉素的培养基中，多种固定的药物浓度下，以较低的密度培养HCV复制子细胞。含有耐药性复制子的细胞将会形成集落，应对其进行基因型和表型鉴定。 l
在不含新霉素的培养基中，多种固定的药物浓度下，进行HCV复制子细胞传代。收集并保存每一代HCV复制子细胞，用于表型和基因型鉴定。 2.基因型分析
针对体外试验中筛选出的耐药株进行基因型分析，确定可能导致病毒对药物敏感性降低的基因突变。针对病毒基因组中的相关部分进行DNA序列分析，鉴定耐药相关突变，这有利于预测临床疗效，并且可以为阐述药物的作用机制提供证据。应测定编码目标蛋白的完整基因序列，对于导致病毒对所研究药物耐药的突变类型和导致病毒对其他同类药物耐药的突变类型进行比较。对于较大的病毒（如疱疹病毒、痘病毒），应对其基因组中与所研究药物作用靶点相关的部分进行测序，并分析其中所含的与耐药性产生相关的突变。建议在几种遗传背景（如毒株、亚型、基因型）中鉴定耐药性产生的通路；通过选择程序获得的毒株如果同时出现了多种突变，则应该鉴定各种突变出现的先后顺序。 进行基因型分析时，鼓励申请人注明测序引物的序列，并说明这些引物可扩增出目标基因的碱基数。还应说明用于检测少数病毒亚群的基因型检测方法的灵敏度。阐明该突变在基因型分析中的比例和种类是十分重要的。 3.表型分析
表型分析用于确定变异株对药物的敏感性是否降低。通过基因型分析鉴定出与耐药性产生可能相关的突变后，如有可能，则应在重组病毒系统（即：使用定点突变技术，PCR扩增突变片段并导入实验室标准株或使用其他适合的系统）中评价每一种突变导致表型耐药的能力。通过体外试验测定重组病毒对药物的敏感性，并确定EC50值。计算突变株与对照株（生物学特性明确的野生型实验室株）的EC50值之比（EC50值增加的倍数）。 任何标准的病毒学试验方法都可用于计算病毒的表型耐药的变化（如病毒相关蛋白检测、PCR检测病毒DNA或RNA、细胞病变检测、MTT法检测细胞毒性、报告基因表达检测等）。通过测定突变株的EC50值，并与在相同条件下同时测得的对照株的EC50值进行比较，计算突变株敏感性的变化（耐药性倍数的变化）。由于试验中测得的EC50值比EC90或EC95值更精确，应优先使用EC50值。表型检测方法的选择取决于其灵敏度，即检测耐药株较对照株的敏感性变化（耐药性的倍数）的能力。计算耐药性的倍数（耐药株的EC50值/参比株的EC50值）时，要求表型检测方法之间具有可比性。 4.交叉耐药性
使用针对相同靶点的抗病毒药物治疗时，对某一种药物敏感性降低的变异，同时也可能会对相同靶点的其他药物的敏感性降低或丧失，这种现象称为交叉耐药。交叉耐药并不一定是可以类推的，因此评价所有可能性非常重要。例如，如果病毒X对A药和B药耐药，而病毒Y也对A药耐药，但病毒Y可能仍对B药敏感。建议通过表型分析评价所研究药物对同类的已上市药物的耐药毒株的有效性，同时评价同类已上市药物对所研究药物的耐药毒株的有效性。此外，如果药物的作用靶点相同，但结构类型不同[例如，核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）和非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs），其作用的靶点都是HIV的逆转录酶]，则建议对不同类型的药物进行交叉耐药性分析。建议检测多种耐药株和临床分离病毒株对所研究药物的表型敏感性（范围应能代表已知可导致病毒对同类型药物的敏感性降低的不同突变和突变的组合）。如果表型检测是在病毒感染细胞系中进行的，则应该使用临床分离病毒株对EC50值进行校验。 应帮助医生及患者了解抗病毒药物的耐药性信息，以协助其做出最佳的治疗决策。除此之外，临床试验方案设计和药物研发计划通常与药物的耐药性和交叉耐药性情况密切相关。因此，强烈建议申请人根据药物预期在临床上应用的实际情况，在药物研发的各期临床试验中进行全面的耐药性监测。 对于某些病毒，病毒载量的变化可作为判定抗病毒药物临床疗效的终点指标。在这种情况下，可以用测定病毒载量的方法进行耐药性监测。基因型和表型检测是考察耐药病毒株是否出现的基础，还有可能表明病毒的耐药性与临床病毒学失败之间的关系。此外，表型和基因型检测结果还可用于指导治疗方法的选择，或预测药物在某一患者个体的疗效。对治疗失败或发生了病毒反弹的患者中分离到的病毒株进行基因型检测可以发现导致病毒对所研究药物敏感性降低的基因突变。此外，进行基线基因型和表型分析，可以根据基线病毒株的突变和多态性及表型敏感性判断治疗结果。如果病毒载量未被作为主要终点指标，则建立检测病毒载量的方法以及监测病毒耐药性的出现对于分析病毒学指标与临床结果之间的关系将非常重要，而且有助于完善拟进行的临床试验的设计。
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