1.2 诱导分化工艺 通过诱导分化，细胞应具备相应的细胞生物学特征，以支持临床拟应用的功能。在定向诱导分化过程中，需结合干细胞的发育或分化进程，引导或调控干细胞变为功能细胞。为有效控制干细胞发生非目标分化，需采用合理的分化诱导剂或适当的分化抑制剂提高定向分化效率。生产工艺应能对不同分化阶段的细胞命运进行有效调控，控制终末细胞不再发生非预期的分化或转分化。对各阶段细胞群的组成、纯度、干性、多能性、分化潜能、标志物表达、生物学功能（分化能力和细胞因子分泌谱）等可选择在合理的分化节点进行监测。 1.3 基因修饰和其他工艺 一些工艺策略，如基因修饰、细胞激活或预处理，可能有助于增强干细胞终产品的期望的生物学活性。其中，通过基因修饰启动或过表达特定治疗活性蛋白，可增强特殊治疗功能。细胞因子刺激、化学物质诱导、物理方式干预（如低氧处理）等，可提高免疫调控功能。采取这些工艺策略时，应进行相关的细胞功能验证，并充分评估引入的安全性风险。 1.4 纯化工艺 纯化工艺的目的在于最大限度地提高纯度，即提高具有特定表型的细胞与总细胞的比值，减少最终细胞产品中的非目的细胞和其他杂质。应对纯化工艺进行开发研究和工艺表征，对各纯化步骤和纯化工艺参数的纯化效率和收率进行评估。 由于非目的细胞成分复杂，其可能是来自不同或同一谱系的细胞，分化不完全的细胞，或不需要的细胞，如未分化的干细胞，纯度分析时应加强对工艺中间品各组分的分析鉴定，尽可能完整地明确各成分的性质，分析非目的细胞的特性。 2. 制剂工艺 2.1 制剂处方 剂型的选择需考虑产品的临床应用、储存和运输的稳定性和安全性等因素。处方的设计和筛选需与剂型相适应，并能有效维持产品的活性和稳定性。根据研究，确定最终制剂和使用方式，如确定是新鲜细胞还是冻存细胞，是游离细胞形式还是与基质结合，是冻存细胞复苏后直接给药还是经洗涤等工艺处理后再给予患者等。同时，还需明确处方组成，制剂规格、细胞浓度等。 2.2 辅料 通过风险评估，并经充分的处方筛选研究和验证，证明选用辅料的科学性和安全性，并明确辅料的来源、质量和用量。辅料的使用应符合药典要求。建议尽量选择低风险的辅料，尽量选用药用级辅料。当使用新型辅料时应参考相关指南开展适当的非临床安全性研究。 2.3 制剂生产工艺 制剂生产工艺需结合产品特点、处方、剂型等研究确定，工艺开发过程中，可应用质量源于设计的理念，关注处方的配制方式、工艺操作时间、灌装准确度、无菌条件控制等。如制剂需要冻存，应开展制剂的冻存和复苏工艺研究，鼓励采用带有在线监测的程序降温先进设备开展不同降温程序研究。对于冷冻保存或以其他方式储存的产品，应确定短期或者长期储存对产品活性和稳定性的影响。 3. 工艺过程控制 干细胞产品复杂，产品质量难以完全精确表征，可应用质量源于设计的理念，加强工艺过程控制。为了控制产品的批间质量一致，可对干细胞产品生产的全过程进行合理的过程控制，包括明确的工艺参数和中控标准，以确保其质量(一致性、纯度和效力)和安全性。这些工艺参数包括特定步骤的培养条件（温度、溶氧、pH、CO2）、工艺添加剂的用量、生产中每个环节的时间控制范围，等等。 同时，可在合理的工艺节点进行工艺中间品检测，检测与产品质量相关的工艺性能指标，如细胞形态、活力、表型特征(包括预期和非预期细胞群)、生物负荷、回收率等，并设置可接受标准，为纠偏限度提供依据。由于干细胞产品一般无法进行终端除菌和除病毒工艺，外源因子污染风险高，生产过程中应在适当环节检测微生物安全性指标（包括无菌、支原体、内毒素等）。 （二）工艺变更 干细胞产品的变更，可参考一般生物制品的可比性研究的基本原则，但由于干细胞产品的复杂性和异质性，现有的药学表征方法很难全面反映变更前后产品质量（安全性、有效性）的差异。在干细胞产品的开发和上市后变更中，可能需要更多借助非临床和临床研究手段。 对于干细胞产品，不能仅靠终产品的检测来说明变更前后产品质量的可比性，变更研究的内容应该覆盖变更前后的原材料比对、工艺过程比对、工艺中间品与终产品的质量属性比对，以及稳定性比对等，其中质量属性比对应该着重关注鉴别、生物学活性以及纯度和杂质等。全面识别各类变更对产品安全性、有效性、质量可控性的潜在影响，科学合理地制定变更策略和研究方案。可以参考 ICHQ5E 的基本原则，设置合理的可比性研究取样点、检测指标及可接受标准，选用变更前后工艺生产的代表性批次进行可比性研究，关注检测项目的全面性、预设对比研究标准设置的合理性、检测方法的有效性和检测结果分析的客观性等。 随着研发的进展，研发过程中可能存在多个阶段不同的生产工艺，如非注册临床工艺、非临床工艺、临床工艺、商业化生产工艺、上市后变更的新工艺等，应具体分析各阶段工艺之间的差异，研究各工艺版本下的产品质量是否可桥接，如有必要，应进一步提供非临床或人体比对研究数据。一般情况下，在确证性临床试验开展前，建议完成所有预期变更。 （三）工艺验证 为了持续生产出质量一致的干细胞产品，进行切实可行的工艺验证十分关键。经过工艺验证后，生产中所有原材料和工艺严格遵循质量控制体系和标准操作规程。 工艺验证时，需采用商业化生产产能下的生产工艺，进行连续多个批次干细胞产品的生产，关注起始原材料等对产品质量的影响。商业化工艺验证自体产品时，应关注同时同阶段最大产能的挑战研究，考虑人员、设备、物料、环境、检测等整体运行能力对生产产能的支持能力，还应着重考虑干细胞的体外扩增能力、代次和分化效率、产品纯度对商业化生产产能的支持能力。应详细记录工艺验证中，不同批次工艺性能和产品质量的变化情况，全面确认生产工艺的稳健性和产品质量的一致性，验证关键生产阶段样品的鉴别、微生物安全性、纯度和生物学活性，评估基因组稳定性等，确保产品的安全性。 考虑到生产工艺对生产终末细胞的影响，需对可传代的终产品进行传代稳定性研究和验证，建议重点关注限传代次下的生长特性稳定性、遗传稳定性、成瘤/致瘤性考察以及终末细胞分化和去分化情况分析等。 在输入人体前，干细胞产品到达医疗机构的运输方式、在医院的使用方法（如复苏、洗涤等）、处理时间和储存条件、期限等也应进行验证。在临床回输操作中，重点关注防范不同类型细胞自身特点所引起的风险（如细胞失活、聚团、丧失干性等），以及临床使用过程中微生物污染的风险。对于新型给药装置和给药方式，需验证给药准确度。
六、质量研究与质量标准 （一）质量研究 由于干细胞产品具有多样性、异质性、复杂性、特殊性、进展性等特性，因此对干细胞产品的质量研究应全面且持续，建议选择代表性的生产批次（如非临床研究批次、临床试验批次、商业化生产批次）和合适的生产阶段样品（例如原代细胞或细胞种子、细胞库、工艺中间品、原液和制剂成品等）进行研究。质量研究内容可结合细胞特性进行选择，尽量覆盖细胞特性分析、理化特性分析、纯度和杂质分析、安全性分析和生物学活性分析等方面，尽可能采用一系列先进、正交的分析技术，且分析方法应经过研究确认，确保方法适用可靠。 1. 细胞特性分析 细胞形态：形态学分析可能对细胞的生长分化状态具有一定的指示作用，可结合各种成像技术进行细胞形态观察，帮助确定细胞的状态。 细胞鉴别：建议从细胞的表型或遗传型等多种维度，采用种属鉴别和细胞谱系等多种方法对细胞进行鉴别，鼓励开发能鉴别潜在污染细胞的方法，控制生产过程中细胞交叉污染的风险。 细胞活性：干细胞产品通常是活的细胞治疗产品，可通过细胞活率、活细胞数、群体倍增时间(PDT)、细胞周期等对细胞活性进行综合评价。 生物标志物：多种表面标志物可对细胞类型、多能性、谱系、终末分化和/或功能进行表征，常采用相关分析检测方法如蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）、流式细胞术、免疫荧光等，进行细胞特性分析。mRNA 标记物与蛋白质标记物表达的有效相关性如果经验证，可使用基于 mRNA 的标记物辅助进行细胞表征。 2. 理化特性分析 一般理化特性分析需结合产品类型和制剂特征开展研究，常包括外观、颜色、pH 值、明显可见异物、渗透压摩尔浓度、装量等项目。
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