3. 纯度和杂质分析 干细胞产品在生产过程中，可能会引入或产生非细胞杂质（如理化杂质）、细胞碎片或非目的细胞，影响产品纯度，并可能带来安全性风险，因此需要根据产品类型和工艺特点，进行全面规范的纯度和杂质研究。 通常纯度分析的研究项目可能包括：活细胞比例、细胞群或亚群比例、目的细胞比例和非目的细胞比例等。经研究，当非目的细胞对产品安全性和有效性无不良影响时，需研究其组成和比例，尽量控制批间一致性。 杂质分析的研究项目包括工艺相关杂质和产品相关杂质。工艺相关杂质是指生产过程中引入的杂质，如残留的外源蛋白、抗生素、诱导试剂、微载体、病毒载体、DNA 等。产品相关杂质如非目的细胞、细胞非预期表达的产物、死细胞残留、细胞碎片和其他可能的降解产物等。对于这些影响产品安全性的杂质成分，应在工艺中予以去除，在质量研究中予以检测，并进行定性/定量控制。需要特别关注的是，产品中可能存在高风险杂质成分的情况下（如 ESC 或 iPSC 残留），应当建立和明确杂质去除方法及杂质残留的定量检测方法。如果杂质成分不能有效去除，则应当在动物模型或其他系统中进行安全性和毒性评估，并根据人体暴露最大剂量或体内安全性研究结果，设定安全合理的残留限度。 4. 安全性分析 4.1 生物学安全性：包括由干细胞产品自身生物学特性所决定的和诱发受者体内其他细胞生物学特性发生改变相关的安全性问题。在对干细胞生物学安全性进行评估时，应考虑相关细胞的临床适应症、给药途径、剂量等与临床治疗直接相关的因素，并利用合适的体内、体外试验模型对相关的生物学安全性进行有效评估。干细胞生物学安全性包括成瘤性和致瘤性、非预期分化、脱靶编辑等。 成瘤性（Tumorigenicity）、致瘤性（Oncogenicity）：药学方面应考虑干细胞产品的成瘤和致瘤风险，特别是高代次的，或经过体外复杂处理和基因修饰的干细胞产品。基于多能干细胞所具有的三胚层分化潜能及其潜在的致畸胎瘤特性，对于 ESCs 和 iPSCs 来源的干细胞衍生产品，应特别关注终产品成瘤性和致瘤性检测。软琼脂克隆形成试验、端粒酶活性检测可一定程度上体外表征产品的成瘤性。 非预期分化：干细胞在体外操作过程中可能分化为非目的细胞。建议开发特定的检测技术（比如高通量测序），研究、评估和监控干细胞产品非预期分化的可能性和影响，可结合目的细胞分化效率进行具体分析。 脱靶编辑：应用基因组编辑技术可能会带来不同程度的非目的基因组编辑风险，出现染色体不稳定和脱靶编辑（如 DNA 插入或删除）等情况。对干细胞进行基因组编辑的产品，应分析和研究基因修饰细胞中的脱靶编辑情况，建议使用包括无偏全基因组分析在内的多重正交方法（例如，计算机、生化、细胞分析方法）识别潜在的脱靶位点。 4.2 微生物学安全性：由于干细胞产品缺少灭菌工艺和去病毒步骤，应在原材料和生产工艺环节中对微生物安全性风险进行控制，具体可参考药典要求和其他有关药品的控制策略。微生物学安全性具体是指：干细胞产品应当不存在各种微生物（细菌、真菌、支原体和病毒等）、微生物代谢产物/衍生物（如细菌内毒素）等的污染。病毒污染包括种属特异性病毒（如人源/动物源病毒）、内外源逆转录病毒以及其他非特定病毒，应根据产品特性于工艺的适当阶段进行相关检测，综合生产全过程评估产品的病毒污染风险。对于逆转录病毒和非特定病毒因子检测，可参考《中国药典》三部通则“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”的相关要求进行。对于使用复制缺陷型等病毒载体获得的干细胞产品，应在产品设计和质量研究时充分考虑控制病毒载体回复突变的风险，复制型病毒（replication competent virus, RCV）的检测要求参考相关指导原则。 5. 生物学活性分析 干细胞产品是活细胞药物，其生物学作用可能是多靶点、多通路的，且不同类型的干细胞产品具有不同的生物学功能。因此，需要基于产品与临床相关的治疗活性或预期的生物学效应，开发能够代表产品作用机制的定量生物学活性/功能测定方法，多活性组分产品应当分别进行鉴定和活性测定。 有时还需开发干细胞生物学活性的替代指标，如在活体系统之外进行的理化分析测定法（physicochemical analytical assay），通过评估产品的免疫化学、生物化学和/或分子属性来提供广泛的产品表征数据。采用的分析测定法应开展替代方法与活性相关性研究，还应证明该测定法可以区分活性产品与非活性或降解形式的产品，并进行充分的对照研究和方法学验证。有些干细胞产品具有复杂的和/或不完全清晰的作用机理或具有多种生物学活性，细胞生物学功能表征须结合体外生物学效应和体内动物模型综合评价。 干细胞产品技术进展和认知更新较快，生物学活性分析需结合产品特点与时俱进。比如目前来看，间充质干细胞（MSCs）的生物学活性主要包括诱导分化功能、免疫调控功能和组织再生功能，其中诱导分化功能包括成骨、成脂、成软骨细胞的分化功能检测，而免疫调控功能可通过检测免疫调控因子等来表征。再如，ESCs/iPSCs衍生细胞的生物学活性是基于分化细胞特殊的生物学功能的检测，或与分化细胞功能相关的特定基因和蛋白质的检测。另外，干细胞生物学活性检测可能还涉及到细胞定向分化效率检测、细胞及细胞外基质/结构的形成、细胞相互作用（如免疫激活或抑制）、细胞的迁移分化或自我更新潜能评估等等。 （二） 质量标准 质量标准的建立主要包括以下过程：确定质量研究的内容、进行方法学研究、确定质量标准的项目及限度、制订及修订质量标准。干细胞产品的质量标准应采用经验证的分析方法，评估产品的鉴别、纯度、无菌性和活性，应体现干细胞产品的质量特点。 质量标准的项目及限度结合质量研究和产品特点确定，限度的设定应能确保产品的安全性、有效性和批间一致性。干细胞产品的质量标准项目一般包括：细胞鉴别、细胞活性（细胞活率、活细胞数、功能细胞数、群体倍增时间）、纯度（如目的细胞比例）、生物学活性（如分化效率、定量/半定量功能测定、标志物）、产品和工艺相关杂质、成瘤性/致瘤性（如适用）、非预期分化、微生物安全性（无菌、内毒素、支原体、内外源病毒）、一般检测（外观、pH 值、明显可见异物、渗透压摩尔浓度、装量）等。如细胞产品曾接受基因修饰，应对每批终产品基因修饰目的细胞的百分比、单个细胞的平均载体或质粒拷贝数、目的基因及其表达产物的功能、脱靶编辑、转导/转染用载体的残留量等进行控制。对于使用复制缺陷型病毒转导的细胞，应证明不存在复制型载体（RCV）。对于运输到医院后需要进行给药前再操作（比如容器的转换、物理状态的转变、与其他结构材料的联合、过滤与清洗等）的干细胞产品，需模拟实际操作开展临床使用相关研究，根据研究结果明确给药前的操作步骤和注意事项，并向医院提供完善的产品信息和操作培训资料，包括针对操作步骤的复核和标签核对等。使用前检查必须至少包含外观、颜色、鉴别和包装完整性等检测。 方法学研究包括方法的选择和方法的验证。干细胞产品方法学研究中需关注的特殊要求，比如：（1）在细胞基质鉴定和检测中使用更先进方法和技术改进时，应开展新旧方法的全面对比验证和检测桥接研究，证明新方法的专属性、灵敏度和精密度至少与现有方法相当。（2）有关生物标志物的分析方法验证应规范开展，特别关注阳性对照的设计与验证。（3）需尽可能采取多种正交的分析检测方法进行生物学活性测定研究，并完成方法学验证。方法研究中还应考虑活性组分之间潜在的非累加效应，例如干扰效应或协同效应。（4）干细胞产品可能包含异质性的细胞群，需采用尽可能敏感的方法定量检测与生物学活性相关的目的细胞和非目的细胞群，方法研究时应特别关注对照的设置与验证。（5）原则上应依据现行版药典中的生物制品无菌和支原体检查法进行干细胞终产品的放行检测，必要时采用快速方法放行应进行方法学验证。快速方法验证时需参考相关指导原则,充分考虑选用代表性污染阳性对照品。在未能充分验证新型方法可以完全替代药典传统方法时，建议在使用新型检测方法进行放行检测的同时，开展药典传统方法的平行检测，同时对检测结果后置可能出现的非预期结果制定处置方案。快速方法应逐步完成与药典方法的比对，以证明检测能力不低于药典法。（6）对于经基因修饰的干细胞产品，如果从最终产品中去除了外源遗传物质，需开发相关的高灵敏检测方法进行确认。 分析检测方法中可能使用参比品/对照品，鼓励开发建立细胞参比品用于干细胞产品的质量控制。用于分析的参比品/对照品需具备代表性和可溯源性，应采用经验证的分析检测方法对其进行充分的特性分析，并鉴定合格。需完成参比品/对照品标定（含量标定和活性标定），并对产品开发各个阶段使用的参考品开展稳定性研究，确定复验期和有效期。
七、稳定性研究 在开展干细胞产品的稳定性研究时，可参考生物制品的稳定性研究的技术要求，如 ICH Q5C 和生物制品稳定性研究技术指导原则。 稳定性研究的目的是为干细胞产品的储存、运输和使用提供支持。研究内容一般包括影响因素试验（温度、光照、机械力等）、加速试验、长期试验、运输试验和临床使用中稳定性试验。试验样品一般包括代表性原液（如有）、成品和需要临时或阶段性冻存的工艺中间品，研究用样品的生产、使用和质量（如总细胞密度和体积范围等） 应可代表实际情况。试验条件应充分考虑新鲜细胞和冻存细胞的区别，考虑干细胞产品保存、包装、运输、临床配伍和实际给药的特殊要求，考虑各个环节样品累积的储存时间对最终产品稳定性的影响等。试验项目应能充分反映考察条件对质量的影响，如细胞活率和活细胞数等细胞特性、生物学活性、细胞纯度、理化特性、微生物安全性指标以及关键辅料含量等。 申报临床阶段的稳定性数据应能够支持临床试验开展，即稳定性研究的期限应至少能够涵盖所开展的临床试验的要求，证明产品从放行至患者给药的有效期是合理的。申报上市时需提供多个代表性批次的稳定性数据以支持和确定贮藏条件、使用条件和有效期，同时应明确产品的敏感条件、细胞状态或质量随时间的变化情况等。
八、包装及密封容器系统 包装及密封容器系统的适用性评估对象是指直接接触产品的包装容器和密封系统。应结合产品给药途径（静脉给药、局部给药、眼用制剂等）、制剂性质（新鲜细胞、冻存制剂等）等，选择合适的内包材（冻存管、西林瓶、软袋等）。 应对直接接触的包装材料和密封容器的功能性和相容性进行研究，功能性研究比如密封性、耐低温性，相容性研究可参考相关技术指导原则开展。
九、名词解释 成体干细胞（Adult stem cells，ASCs）：源自已经发育的胚胎组织、成人组织（如牙齿来源、脂肪来源等）或出生伴随的附件组织（如脐带、胎盘）的未 分化细胞，可自我更新，并且具有向一种或多种终末功能细胞分化的潜能。如间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、造血干细胞（hematopoietic stemcell, HSC）、神经干细胞(neural stem cell，NSC)、皮肤干细胞 （keratinocytestem cell, KSC）等。 人胚干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）：源自人着床前胚胎中未分化的初始细胞，其体外培养期限自受精或核移植开始不得超过 14 天，可在体外无限制地自我更新，并且具有向三胚层细胞分化的潜能。 诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）：由人体细胞经重编程而获得的具有无限自我更新能力和向三胚层细胞分化潜能的一种干细胞，具有类似于人胚干细胞的多能性。 转分化（Transdifferentiation）：体细胞或成体干细胞通过基因修饰、化学诱导等方法，不经过多能干细胞状态，直接转化为不同胚层或不同谱系其他体细胞或干细胞的过程。 畸胎瘤（Teratoma）：一种含有三胚层的分化组织和细胞的良性肿瘤。科学界常通过注射干细胞到免疫功能缺陷的小鼠体内的方法,验证所产生的畸胎瘤包含三个胚层细胞。可用于确定是否建立了人胚干细胞系或人诱导多能干细胞系。 饲养层细胞（Feeder layer cell）：通过细胞-细胞相互作用或分泌一定营养物质，用于支持其他细胞生长、扩增的细胞。
十、 参考文献 [1] 国家食品药品监督管理总局. 细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行). 2017. [2] 国家药典委员会. 《中华人民共和国药典》(2020 年版)[M]. 2020. [3] 国家卫生和计划生育委员会与国家食品药品监督管理总局. 干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行). 2015. [4] 卫生部. 人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点. 1993. [5] 卫医发[2000] 184 号《临床输血技术规范》. [6] 科技部和卫生部. 人胚胎干细胞研究伦理指导原则. 2003. [7] 卫生部. 涉及人的生物医学研究伦理审查办法. 2016. [8] 国家食品药品监督管理局. 药物临床试验伦理审查工作指导原则. 2010. [9] ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation. 2021. [10] FDA. Guidance for FDA Reviewers and Sponsors. Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Somatic Cell Therapy Investigational New Drug Applications (INDs). 2008. [11] FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs). 2020. [12] FDA. Deviation Reporting for Human Cells,Tissues,and Cellular and Tissue-based Products Regulated Solely Under Section 361 of the Public Health Service Act and 21CFR Part 1271. 2017. [13] FDA《Guidance for Industry；Potency Tests for Cellular and Gene Therapy Products》. 2011. [14] EMA. Reflection paper on stem cell-based medicinal products. 2011. [15] PMDA. ヒト ES 細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保について. 2012. [16] ICH Guidance on Quality of Biotechnological/Biological Products: Derivation and Characterization of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products, (63 FR 50244, September 21, 1998). [17] ICH. Q5E Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in Their Manufacturing Process. 2004. [18] ICH. Q5C Stability Testing of Biotechnological and Biological Products.1995. |
