注释6：试验方案选择
对于化学药物来说，如果给药剂量达2g/kg而不致死，且重复给药毒性试验剂量达1g/kg时未出现毒性，可仅进行单项包括两代的生殖毒性试验，包括两受试物组（0.5 g/kg和1.0 g/kg）与一个对照组。但应关注种属动物选择的合理性以及受试物有效性。 此外，对多巴胺受体激动剂或减少循环中催乳素水平的受试物，雌性大鼠为较差的模型动物，而家兔可能是用于上述受试物所有生殖毒性研究的更好的动物种属，但目前似乎尚未进行这种尝试。若有证据显示家兔的代谢方式比大鼠与人更接近，则家兔也可用于其他类型受试物的生殖毒性研究。 注释7：常规试验与后续试验
常规试验（指导原则规定的试验）在不同程度上具有难以判断的特点，即对某一指标影响的产生，可能有多种不同原因。例如，出生时每窝幼仔数的减少可能是因为排卵率（黄体数）的减少、着床前死亡率的提高，或因为着床后死亡率或出生后立即死亡率的增加所致。而上述死亡可能是其早期胎体畸形的后果，由于随后的继发性改变等原因，该畸形不能够再观察到。尤其是那些在对照组中已表现出的低发生率的反应，给药所致影响与偶然出现的情况间的区别，就要根据其与其他类型影响的关系来判断。因此，若发现对某一指标的影响，应考虑进行后续试验以探索其可能的联系，明确其毒性的性质、范围和原因，也包括判断其剂量-反应关系以便有助于其危险性评价。这不同于常规试验的情况，此时剂量-反应关系存在与否，将有助于区别给药所致影响与偶然情况的不同。 注释8：计时方法
本指导原则中，妊娠的计时方法为以观察到阴道涂片精子阳性和/或阴栓的日期计为妊娠第0天。大鼠和家兔的着床发生在妊娠的第6～7天，硬腭闭合在第15～18天。 其他计时方法也可接受，但必须在报告中明确说明。另外，研究者必须在不同的研究中保持计时方法的一致性，以确保给药过程中不出现空隙。建议在相关研究的给药期之间，应设计至少一天的重叠期。 交配时间会影响胎仔和幼仔相关参数的变异性，应确认准确的交配时间。 通常，幼仔动物的出生日即计为产后或哺乳的第0天。可借助准确的交配日期来判断是否出现分娩延迟或滞产。 注释9：动物数
对动物数的要求，总体原则是满足数据分析的需要。考虑到国内的现实情况，本指导原则中仍然保留了对动物数的最低要求。该要求主要参考了ICH相关会议纪要中美国、欧盟、日本对动物数要求。 注释10：给药时间
生育力试验，尤其减少雄性动物交配前给药期，应根据前期试验所积累的资料以及对精子发生过程基础研究的再评价而设计（对精子发生的研究以往尤其要求较长的交配前给药期）。但选择性影响雄性生殖功能的受试物是罕见的，通过与雌性动物交配来观察受试物对精子发生影响这一方法是不灵敏的；而充分的雄性动物生殖器官病理学和组织病理学检查(如通过Bouin's固定、石蜡包埋、睾丸2～4 µm横切片，附睾纵切片，PAS和苏木素染色)则是检查对精子发生的影响的一种更为敏感和快捷的方法。影响精子发生的受试物一般作用于分裂后期。尚无仅通过雄性动物给药9～10周并与雌性交配，来发现雄性生殖方面毒性的有说服力的例子（试验）。生育力试验可对重复给药毒性试验中组织学检查不能观察到的受试物对雄性生育力的功能性影响，以及对雌雄动物交配行为的影响进行评价。 重复给药试验可提供受试物对精子发生的潜在影响的信息。评价对精子的影响应参考至少1个月的重复给药毒性试验的结果。如果在1个月以上的重复给药毒性试验中未发现任何毒副作用，那么在交配前雄性动物给药周期可缩短至4周。 已有研究显示大鼠精子发生（包括精子成熟）整个过程需63天，若已有的资料提示生育力的研究范围需扩大或需明确其作用性质，则应合理设计试验以对其进行进一步的研究。 注释11：动物处理
雌雄动物比例：雌雄动物最好以1:1比例进行交配，因为不管是为了取得高的受孕率还是为了避免试验结果的错误分析和阐述，这都是最安全的方法。 交配时期和方法：大部分实验室采用2～3周的交配期。 在一些实验室中，一旦阴道涂片阳性或查到阴栓即将雌性动物移走，而另一些实验室则继续使雌雄动物同笼。大部分大鼠在同笼的最初5天内即可交配（在第1个动情期内），但某些雌鼠可能出现假孕。在此情况下，可将雌雄大鼠同笼约20天，使雌性动物重新开始动情期以受孕。 终末处死：如果雌性大鼠在胚胎着床后停止给药，在其妊娠13～15天时处死，通常可满足评价对生育力和生殖功能影响的需要，例如可区分着床与吸收胎。为观察不良反应（在生育力研究中没有必要），获得后期胚胎丢失、胎仔死亡或结构畸形等资料，雌性动物一般在妊娠20/21天处死，雄性动物建议在交配成功后处死。结果模棱两可时，可将雄性动物与未给药的雌性动物进行交配以检查雄性动物是否有生育能力。 注释12：观察指标
本指导原则中仅列出常规指标，应根据受试物、临床适应症、用药人群特点等具体情况，增加相关观察指标。 给药期间每日对妊娠动物称重是有意义的。对某些受试物，在非妊娠期（交配前、交配期与哺乳期）则最好每周称重2次以上。 对明显未妊娠的大鼠或小鼠（不包括家兔），可进行子宫硫化胺染色，以确定是否有胚胎死亡。 注释13：胚胎-胎仔发育毒性试验中的第二种动物
通常胚胎-胎仔发育毒性带来的后果相对更为严重，故对其试验结果应更为关注。采用多种动物进行试验，在将试验结果外推至人时可能会有更为充分的试验依据。通常，胚胎-胎仔发育毒性试验需要采用至少两种动物进行，推荐采用大鼠和家兔。 注释14：体格发育、感觉功能、反射和行为
评价体格发育的最佳指标为体重。离乳前体格发育的标志如耳廓张开、毛发生长、门齿萌出等均与胎仔体重具有高度相关性。胎仔体重与交配后时间的相关性大于体重与出生时间之间的相关性。平面翻正反射、听觉惊跳反射、空中翻正反射和对光反射等依赖于身体发育的状况。 离乳后体格发育的两项明显标志是雌鼠阴道张开和雄鼠龟头包皮腺裂开。后者与睾酮水平升高有关，而睾丸下降与睾丸酮水平无关。这些标志意味着性成熟的开始。 功能测试：至今为止，功能测定绝大多数为行为试验，虽然人们已在此方面花费了很多精力，但尚未找到可推荐的特异性测试方法。研究者们正努力寻找可测试感觉功能、自主活动、学习和记忆的方法。 注释15：生殖毒性研究的阶段性
胚胎-胎仔发育毒性带来的后果相对更为严重，对该段试验结果应更为关注，如果采用多种动物进行试验，在将试验结果外推至人时可能会提供更为充分的试验依据。 考虑到目前我国的现状，由于创新药物没有或仅有较少的可以参考的资料，需要更加关注对人体安全性。为了将受试者（及其后代）的风险降至最低，并为合理用药、利弊权衡提供参考，在临床研究开始前应尽可能了解受试物对雌雄动物生殖能力、生殖器官、生殖细胞以及早期胚胎发育的影响。因此，目前要求生育力与早期胚胎发育毒性试验和胚胎-胎仔发育毒性试验在临床试验开始前完成。 在某些特殊情况下，如用于艾滋病、晚期恶性肿瘤等治疗的药物以及用于生殖控制、孕妇等特殊人群的药物，可灵活考虑生殖毒性的要求，如研究内容和具体设计、动物种属和阶段性等。 此外，在常规试验后，发现了某些不良影响，为弄清该影响的实质及其发生的机理而外推至人，进行适当的后续试验是很重要的。对于后续试验的时间安排应视具体情况灵活掌握。 |
