由于手性药物具有立体结构，并且在非手性条件下，对映体一般具有相同的熔点、溶解度、色谱保留行为、红外光谱（Infrared Spectroscopy，IR）、核磁共振谱（Nuclear Magnetic Resonance，NMR），因此手性药物结构确证具有一定的特殊性，在进行结构确证时，除应符合结构确证的一般原则外，还应特别注意对其构型进行研究与确证。 手性药物结构确证的总体原则：应注意确证手性药物分子的绝对构型，对各手性中心的绝对构型是R还是S（或其它的绝对构型表示方式）均应确证清楚。对于单一的立体异构体，只需确证该分子中各手性中心的绝对构型；而对于立体异构体的混合物，则需要对各立体异构体的绝对构型及立体异构体间的比例进行确证。 构型的确证方法大体分为两类：直接法与间接法。直接法是指只需通过某一单一的方法即可确证手性药物的构型，例如，单晶X射线衍射法（Single-crystal X-ray
Diffraction，SXRD）；间接法是指仅靠对待测物进行分析，尚难以确证其构型，而需综合其它数据，如与其同系物的相关分析数据相结合才能确定待测物的构型。例如，比旋度、手性色谱、核磁共振以及旋光光谱（Optical Rotatory Dispersion，ORD）、圆二色谱（Circular Dichroism，CD）等分析方法都属于间接法。化学相关法也属于间接法。 除下面介绍的仪器分析方法外，也可采用化学相关法确证手性药物的构型。在手性药物的制备过程中构型的变化是已知的情况下，根据起始原料的构型、化学合成方法的立体选择性以及各中间体的立体结构也可间接获得最终产品（药物）的构型信息。该方法在仪器分析方法成熟以前使用较多。 在确证手性药物的结构时，可采用常规方法确证药物的结构式；然后再根据手性中心的数量、起始原料的构型、化学合成方法的立体选择性、文献数据、对照品等相关信息，有针对性地选用比旋度测定、手性高效液相色谱法（High
Performance Liquid Chromatography，HPLC）或气相色谱法（Gas Chromatography，GC）、化学相关法、SXRD、CD、ORD以及奥氏核效应（Nuclear Overhauser Effect，NOE）差谱等方法对其绝对构型进行确证。因为比旋度测定相对比较简便，且与分子的构型有一定的相关性，所以一般情况下比旋度是必需的检测项目之一。 此外，在绝对构型的确证中，为保证结果的准确性，除采用一种方法外，需考虑采用另一种方法加以确认。 下面对手性药物构型确证的主要方法分别进行简要介绍。 1．X射线衍射法（X-ray Diffraction，XRD） 由于单晶X射线衍射法可以独立确定分子的绝对构型，所以在其他相关信息比较缺乏的情况下，如要确证手性药物的绝对构型，建议采用单晶X射线衍射法。 单晶X射线衍射法是通过单色X光源，常用CuKα(1.54178Å)与MoKα（0.71073Å）对具有一定几何尺寸大小（0.01 通常可采用四圆衍射仪（低功率光源）、CCD衍射仪（低功率光源）或IP面探测仪（高功率光源）进行手性药物分子构型的测定。 单晶X射线衍射法测定分子绝对构型包括直接与间接两种方法： 直接法：其测定原理是应用不同化学元素对X射线的反常散射（色散）效应。若待测药物样品仅含有C、H、N、O元素时，应使用CuKα辐射，衍射实验的θ角度不低于57o；若待测样品中含有原子序数大于10的元素时，可以应用MoKα辐射，衍射实验的θ角不低于25o。 间接法：利用分子结构中部分已知构型的基团确定分子构型。衍射实验采用CuKα或MoKα辐射均可。 应注意的是：由于单晶X射线衍射结构分析的对象仅为待测样品中的一颗晶体，样品缺少普遍性，需对药物样品进行粉末X射线衍射（Powder X-ray Diffraction，PXRD）实验，用单晶结构数据计算该构型手性药物的理论粉末X射线衍射图谱，并与实验粉末X射线衍射图谱比较，当二者一致时即可证明衍射用单晶具有普遍性，从而确定手性药物的构型。 2．圆二色谱 该项测试的原理主要是通过测定光学活性物质（待测物）在圆偏振光下的Cotton效应，根据Cotton效应的符号获得药物结构中发色团周围环境的立体化学信息，并与一个绝对构型已知的与待测药物结构相似化合物的Cotton效应相比较，即可能推导出待测物的绝对构型。 此外对于一些具有刚性结构的环体系的羰基药物，通过比较其Cotton效应的符号并结合经验规律“八区律”，亦可能预言某些羰基药物的绝对构型。 3．旋光光谱 手性药物（溶液）在偏振光下存在旋光现象，其旋光值随入射偏振光波长的改变而改变。在同系物中，相同的化学反应使旋光值按相同的方向改变，而不改变其旋光的方向，通过比较相关化合物（药物）的旋光性，可得到手性药物的相对构型信息。如能得知药物旋光光谱的可测范围，则在一系列反应后，药物绝对构型可从用于制备该药物的底物构型推导得到。 应注意的是，在采用该方法测定药物绝对构型时，应与绝对构型已知且与待测药物结构相同或相似化合物，在相同的实验条件下测定旋光光谱，以保证比较结果的可靠性。 4．核磁共振法 4.1
NOE差谱 通过对具有刚性结构（或优势构象）药物分子中某一质子的选择性照射，致使与该质子在空间上距离较近的相关质子峰强度的增减和相互间偶合作用的消失，从而推测出相关质子在空间的相对位置，进而可获得药物的构型信息。 4.2 通过测定手性衍生物的NMR来确定其绝对构型。 待测手性分子与已知构型的一对对映异构体反应，生成两个非对映异构体后，分别测定各自分子中氢的化学位移，通过化学位移的比较，并结合计算等方法，从而推导出该手性分子的绝对构型。 例如，Mosher法【5】是将待测手性醇（或胺）与（R）或（S）-α－甲氧基－α－三氟甲基－α－苯基乙酸（MTPA）反应生成相应的酯或酰胺，然后测定该酯或酰胺的核磁共振氢谱。由于该方法已事先研究确定了两种不同构型的手性醇（或胺）生成相应的酯或酰胺后，手性碳上的氢的化学位移的变化规律，所以根据实测的化学位移的变化情况即可确定该手性醇（或胺）的绝对构型。由此可见，这类方法也属于间接法，可用于判断创新药物的绝对构型。 |
