抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则（国食药监注[2006]639号） ...

附录一：

抗HIV药物非临床药效学研究的一般方法

HIV可用传代人T淋巴细胞或原代人外周血单个核细胞培养，T嗜性的病毒株可导致人T淋巴细胞出现特征性细胞病变，如细胞融合、多核巨细胞等。M嗜性的病毒株一般不导致细胞病变，可通过检测培养上清液的HIV p24抗原、病毒RNA或逆转录酶活性监测病毒复制的情况。体外药效学试验一般应重复三次。

目前尚缺乏理想的HIV感染动物模型，常采用替代模型或经过改造的小动物模型来评价药物的体内抗HIV活性，如感染猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）或嵌合病毒（Simian/human immunodeficiency virus ，SHIV）的猴模型和感染HIV的人淋巴组织重建的严重联合免疫缺陷小鼠模型(Sever combined immunodeficient-human，SCID-hu)。

本附录收入了目前较成熟和常用的抗HIV体外、体内药效学试验方法，供研发者参考。今后可根据研究进展情况进一步修订。

一、体外药效学试验

1、病毒和细胞

（1）病毒：应尽可能选择多种生物学表型和基因型的病毒株，包括HIV实验室适应株和有代表性的HIV临床分离株。在进行抗HIV耐药性毒株的药效学研究时，应选用耐药性毒株；对于明确作用靶点的药物，应首先选择对该作用靶点药物耐药的毒株。

（2）细胞：应尽可能选择多种细胞。常用的有传代人T淋巴细胞系（如CEM、MT4、MT2、C8166、H9等）、单核巨噬细胞系（如U937等）和活化的人原代外周血单个核细胞（PBMC）。

（3）病毒感染剂量的确定：测定HIV的感染剂量一般采用在96孔细胞培养板上微量培养滴定的方法，通过观察细胞病变或检测病毒标记物，如HIV p24抗原或逆转录酶等，计算出病毒的感染性滴度（半数组织培养感染剂量，50% Tissue culture infectious dose， TCID₅₀）。在不同的细胞系/病毒株培养系统，使用的病毒感染剂量不尽相同，一般选用100～1000TCID₅₀。

2、药物的细胞毒性测定：将不同浓度的药物加入细胞培养板中，在特定条件下培养一定时间，用适宜的方法测定活细胞的比例，计算药物对细胞的毒性（半数细胞毒性浓度，Median toxic concentration，TC₅₀）。

3、抗HIV活性测定：

（1）试验分组

空白对照组：正常培养的细胞。

阳性对照组：阳性对照药与病毒和细胞共同培养。阳性对照药一般选择与受试药物作用靶点相同的临床有效药物。

阴性对照组：药物溶媒与病毒和细胞共同培养。

病毒对照组：病毒和细胞共同培养。

药物对照组：受试药物与细胞共同培养。

试验组：受试药物与病毒和细胞共同培养。

（2）感染和给药方法：一般采用药物、病毒、细胞同时培养的方式，也可以根据药物作用的靶点采取药物先与HIV作用再加细胞、药物先与细胞作用再加HIV或HIV先感染细胞再加药物的感染和给药方式。

（3）监测指标和方法：

细胞病变：在显微镜下观察细胞的形态，观察有无HIV特征性的细胞病变（合胞体以及细胞融合）。

HIV抗原：用ELISA方法检测培养上清液中的HIV p24 抗原浓度。

逆转录酶：用同位素掺入或其他方法检测培养上清液的逆转录酶活性。

根据细胞病变观察、p24抗原或逆转录酶检测的结果，计算药物对病毒的抑制活性（半数抑制浓度，Median inhibition concentration,  IC₅₀）。

4、药效学评价指标

由于病毒的存活与复制依赖于宿主细胞，而抗病毒药物本身有一定的细胞毒性，因此不能仅以细胞病变、p24抗原或逆转录酶活性作为药效学评价的指标，而应以治疗指数（TI）为主要的评价指标。一般认为治疗指数大于10的药物可能具有体外抗HIV活性。

5、药物的联合抗HIV活性测定

将2～3种不同的药物加入到同一实验体系中，按照前述的方法监测病毒的抑制情况，判断药物对病毒的联合作用。实验中除了设置一般体外药效学研究需要的对照以外，还应有各单药对照。联合抗HIV活性测定的数据分析方法比较复杂，需采用特定的模型和软件。

二、体内药效学试验

1、SIV感染猴模型

（1） 病毒：SIV毒株，静脉注射或粘膜感染。

（2） 动物：恒河猴、食蟹猴等，体重5公斤左右，动物数应满足评价的要求，一般每组4～6只。

（3） 病毒感染剂量的测定：可采用两种方法，一种方法是用保存的毒种在体外感染猴淋巴细胞，初步确定病毒的感染剂量。一般选择三个剂量组，每组间10倍稀释，每个稀释度接种两只猴，感染后不同时间取血，通过细胞培养测定病毒滴度，并定量检测SIV RNA，以两只猴均感染的最小剂量作为最小感染量（Monkey infectious dose，MID₁₀₀）。另一种方法是用感染猴的血浆接种猴，感染后每周取血测定SIV抗原和细胞培养病毒，计算半数感染量（Median infectious dose, ID₅₀）。

（4） SIV感染猴治疗试验：

急性感染治疗试验：猴静脉注射10～100ID₅₀ 或5MID₁₀₀ 的SIV，同时或4小时后口服或注射最大无毒剂量以下2倍递减2个剂量的药物，每天给药，连续8周。每周取血，培养病毒，测定SIV p27抗原滴度和SIV RNA，计算保护百分率，并与病毒对照组进行比较。给药前、停药当天和停药后8周进行淋巴结检查，观察免疫系统的病理改变。另外，还要测定CD₄⁺、CD₈⁺细胞数和CD₄⁺/ CD₈⁺比值。

慢性感染治疗试验：猴静脉注射10～100ID₅₀或5～10MID₁₀₀ 的SIV，感染后60天左右开始给药，一般试验组在最大无毒剂量以下2倍递减2个剂量。每天给药，连续8周。于给药前、给药第8周、停药当天和停药后8周取血，测定SIV p27抗原滴度和SIV RNA，计算保护百分率，并与病毒对照组进行比较。给药前、停药当天、停药后8周进行淋巴结检查，观察免疫系统的病理改变。另外，还要测定CD₄⁺、CD₈⁺细胞数和CD₄⁺/ CD₈⁺比值。

2、HIV感染SCID-hu小鼠模型

（1）动物：SCID小鼠，4～8周龄，雌性，静脉注射人PBMC或移植人胚胸腺/肝脏组织。

（2） HIV感染剂量测定：将HIV细胞培养上清液10倍连续稀释5个浓度，静脉注射或移植组织注射感染小鼠。1周后取小鼠的血液、脾、淋巴结和腹腔洗液，定量培养，测定病毒滴度，HIV p24抗原、病毒载量，计算ID₅₀。

（3）药物毒性测定：SCID-hu小鼠灌服或静脉注射给药，测定急性毒性和亚急性毒性，计算半数致死量（Median lethal dose, LD₅₀）和最大耐受量（0% Lethal dose, LD₀）。

（4）HIV感染SCID-hu小鼠药物治疗试验：SCID-hu小鼠腹腔注射10～100ID₅₀ HIV，2～24小时后灌服或静脉注射给药。感染1周后，取血液、脾、淋巴结和腹腔洗液，定量培养，测定病毒滴度，HIV p24抗原、病毒载量，计算抑制率和半数有效剂量（Median effective dose, ED₅₀），并与病毒感染对照组进行比较。