附录A 嗜渗酵母计数 A.1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： A.1.1 恒温培养箱：25 ℃±1 ℃。 A.1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 A.1.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 A.1.4 天平： 感量 0.1 g。 A.1.5 无菌试管：18 mm×180 mm。 A.1.6 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度），10 mL（具 0.1 mL 刻度），或微量移液器及吸头。 A.1.7 无菌锥形瓶：500 mL，250 mL。 A.1.8 无菌培养皿：直径 90 mm。 A.1.9 无菌 L 型涂布棒：玻璃、塑料或者不锈钢材料制成，棒体直径不应大于 2 mm。 A.1.10 显微镜： 10×～100×。 A.2 培养基和试剂 A.2.1 30％葡萄糖溶液（pH
6.5±0.5） A.2.1.1 成分 无水葡萄糖
30.0 g 蒸馏水 100 mL A.2.1.2 制法 称量适量葡萄糖，溶解在蒸馏水中，必要时调节 pH 为 6.4 左右。分装后，115 ℃高压灭菌 20 min。 A.2.2 氯硝胺
18%甘油（
DG18）琼脂 A.2.2.1 成分 酪蛋白胨 5.0 g 无水葡萄糖 10.0
g 磷酸二氢钾 1.0 g 硫酸镁（MgSO４·H２O） 0.5 g 氯硝胺 0.002 g 无水甘油 200 g 琼脂 15 g 氯霉素 0.1 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2.2 制法 除氯霉素外，将全部成分加热煮沸至完全溶解，如有必要，调节 pH 为 6.4 左右。加入抗菌素，121 ℃高压灭菌 15 min，最终的 pH 应为 5.6±0.2。灭菌后，立即在 44 ℃～47 ℃水浴冷却至 50 ℃以下，在每个灭菌平皿中倾注大约 15 mL～20 mL 培养基，放置在水平的台面上冷却固化备用。如有必要，可以放在 36 ℃培养箱中过夜，使琼脂表面干燥无水珠。避光保存。 A.3 检验程序 嗜渗酵母检验程序见图 A.1。
A.4 操作步骤 A.4.1 样品采集和保存 样品采集后，应尽可能及时检验。若不能及时检验，普通样品应置 2 ℃～5 ℃冰箱保存，在 24 h 内检验。冷冻样品应在 45 ℃以下不超过 15 min 或在 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。 A.4.2 样品稀释 A.4.2.1 取样 以无菌操作在天平上称取固体或液体检样 25 g，加入 30％葡萄糖稀释液 225 g，用旋转刀片式均质器以 8000 r/min 均质 1 min，或拍击式均质器拍击 2 min，制备成 1:10 的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放入加有玻璃珠的无菌锥形瓶中，并充分振荡。 A.4.2.2 梯度稀释 用灭菌吸管吸取 1:10 稀释液 1 mL，注入含有 9 mL 30％葡萄糖稀释液的试管内，置于漩涡混悬仪上混匀，制备 1:100 的稀释液。 另取 1 mL 灭菌吸管，按前操作依次制备 10 倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用 1 支 1 mL 灭菌吸管。 A.4.3 涂布和培养 A.4.3.1 根据对检样污染情况的估计，选择 2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种 2个 DG18 琼脂平板。在充分混合稀释液之后，立即在每个平板表面接种 0.1 mL，接着用无菌的 L 型涂布棒进行充分的琼脂表面涂布。注意涂布棒下端不得触碰培养皿的侧缘。进行样品检验的同时，应同时在 2 个 DG18 琼脂平板表面接种 0.1 mL 的稀释液作为空白对照。 A.4.3.2 接种完成后，尽快将全部平板置 25 ℃±1 ℃恒温箱内避光培养。培养时勿翻转培养皿。为防止出现霉菌的过度蔓延生长掩盖了目标菌落，在培养 48 h 后，即开始每日观察平板上面真菌生长情况。培养 7 d 结束。 A.4.4 菌落计数 A.4.4.1 选择菌落数量在 15～150 之间的平板，计数菌落数量。 A.4.4.2 典型的嗜渗酵母在 DG18 琼脂平板上呈现为圆形、中心隆起、不透明、边缘整齐的菌落，直径 1 mm～2 mm。必要时，可利用低倍显微镜直接观察平板上生长的菌落是否为细菌菌落。如出现霉菌菌落干扰时，不应计数丝状菌落。 A.4.5 报告 参照 GB 4789.2 的报告方式，以 CFU／g 为单位报告样品中嗜渗酵母的数量。 |
