四、猴痘病毒核酸检测要求及流程 （一）实验室资质要求。 开展猴痘病毒核酸检测的实验室，应当符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院令第424号）或《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号）有关规定，具备设区的市级卫生健康部门备案的生物安全二级（BSL-2）实验室及以上实验室条件，并备案猴痘病毒相关实验活动。独立设置的医学检验实验室还应符合《医学检验实验室基本标准（试行）》《医学检验实验室管理规范（试行）》等要求。 开展猴痘病毒分离、培养、中和等涉及病毒扩增、使用等实验操作的实验室应具备国家卫生健康委批准的生物安全三级（BSL-3）实验室及以上实验室条件，且获得猴痘病毒实验活动批准。分离的猴痘病毒应送国家病原微生物保藏中心/国家病原微生物资源库病毒分库保藏。 （二）实验室生物安全要求。 根据2006 年公布实施的《人间传染的病原微生物名录》（简称《名录》），猴痘病毒生物危害分类为第一类，是一种高致病性病毒。按照《名录》要求，猴痘病毒的分离、培养等涉及病毒扩增及使用的实验操作需在BSL-3 及以上实验室的生物安全柜内进行；非灭活采样液采集的猴痘病例样本的灭活在BSL-3实验室进行；样本灭活后猴痘病毒DNA 提取、检测可在BSL-2及以上实验室或PCR 检测的专门区域或房间进行。如《名录》更新，开展猴痘病毒操作的实验室生物安全要求应按最新《名录》执行。污水样本的灭活参照普通生物样本。 （三）实验室分区要求。 原则上开展猴痘病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增和产物分析区。三个区域在物理空间上应完全相互独立，空气应定向流通。各区功能分别是： 1.试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的制备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。 2.标本制备区：转运桶开启、标本灭活，核酸提取及加入至扩增反应管等。 3.扩增和产物分析区：核酸扩增和产物分析。 根据使用仪器的功能，区域可适当合并。如采用标本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，标本制备区、扩增和产物分析区可合并。 （四）主要仪器设备。 实验室应当配备与开展检验项目相适宜的仪器设备，包括：二级生物安全柜、高速台式离心机、干浴恒温器、荧光定量PCR仪、计时器、移液器。 （五）实验室猴痘病毒核酸检测流程。 实验室接到标本后，按照标准操作程序进行试剂准备、标本前处理、核酸提取、核酸扩增、结果分析及报告。实验室应当建立可疑标本和阳性标本复检流程。 1.试剂与材料。 （1）标本：包括病变表面拭子、痘疱液或痘疱渗出液拭子、痘痂或痘痂拭子、咽拭子、全血或血浆等标本。 （2）核酸提取试剂盒（基因组DNA 提取试剂盒）：组织基因组DNA 提取试剂盒或血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒。 （3）核酸检测试剂： ①试剂：DNA 聚合酶或预混的PCR 反应试剂（PCR
MasterMix）。 ②猴痘病毒检测引物、探针: ________________________________________________________________ 名称 简称 浓度 序列 ________________________________________________________________ Primer-F F3L-F 10μM 5′-CTCATTGATTTTTCGCGGGATA-3′ Primer-R F3L-R 10μM 5′-GACGATACTCCTCCTCGTTGGT-3′ Probe F3L-P 10μM 5′FAM-CATCAGAAT
CTGTAGGCCG T-MGB 3′ _______________________________________________________________ ③阳性对照：涵盖检测靶标序列的质粒。 （4）灭菌去离子水、无水乙醇 （5）消毒液 ①75%乙醇：用于手部和物体表面常规消毒，开启后有效期为1 周。 ②含氯消毒液：现用现配，含有效氯1000mg/L 的消毒液用于物体表面常规消毒，含有效氯5000mg/L 的消毒液用于感染性材料溢洒时的应急处理。 （6）耗材：包括带滤芯的吸头、螺旋口的离心管、非螺旋口的离心管、含锆珠的粉碎管、PCR 反应板和透明封膜或PCR 反应管和透明盖。 （7）BSL-2 个人防护用品：包括KN95/N95 口罩及以上级别的口罩、一次性隔离衣、防护眼罩或面屏、一次性帽子、鞋套、靴套和手套。 2.实验前的标本接收。 （1）核对被检标本编号、姓名、性别、年龄及检测项目； （2）待检标本的状态如有异常，需注明； （3）待检标本长期存放在-70℃，短期存放可在-20℃，避免反复冻融。 3.核酸检测操作步骤及注意事项。 （1）病毒核酸（DNA）的制备 操作方法按DNA 提取试剂盒相应说明书进行操作，具体如下： ①提取试剂准备：第一次开启试剂盒，在使用前先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上标签。所有试剂在使用前应平衡至室温；所有离心步骤应在室温下进行。 ②处理样本： A.痘疱液：干拭子标本需以适当体积的含PS的PBS或DMEM重悬后检测。取100μL样本，加入80μL缓冲液，总量为180μL；标本体积不足100μL时用缓冲液补足总体积至180μL； B.病变皮疹或痘痂：取1块痂皮按质量/体积（1mg/50μL）加入相应体积含PS的PBS，研磨或匀浆处理，取80μL，然后加入100μL缓冲液； C.咽拭子、其它拭子：从采样液中取200μL标本，干拭子标本可用3mL含PS的PBS或DMEM重悬，混匀后取200μL； D.全血或血清：直接取200μL标本。 ③加入20μL 蛋白酶K 溶液，混匀，溶液会变清亮。若样本为病变皮疹或其它组织时，加入蛋白酶K 混匀后，在56℃放置，直至组织溶解，再进行下一步骤。 ④加入200μL 裂解缓冲液，充分混匀，70℃放置10 分钟，或至溶液变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。 需注意：加入裂解缓冲液后可能会出现白色絮状沉淀，在70℃放置后会消失。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少或提取出的DNA不纯。 ⑤加200μL 无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁水珠。 ⑥将上一步骤所得溶液和絮状沉淀均加至吸附柱中（吸附柱放入废液收集管中），8000rpm 离心1 分钟，弃废液。 ⑦加入500μL 漂洗缓冲液1（使用前先检查是否已加入无水乙醇），8000rpm 离心1 分钟，弃废液。 ⑧加入500μL 漂洗缓冲液2（使用前先检查是否已加入无水乙醇），最大转速13000rpm 离心3min，弃废液。 ⑨将吸附柱放回废液收集管中，最大转速13000rpm 离心1分钟，尽量去除漂洗液。 ⑩将吸附柱转入一根干净的离心管中(需自行准备，试剂盒中未提供)，加入50μL 洗脱缓冲液或灭菌去离子水，室温放置2-5 分钟，8000rpm 离心1 分钟。收集滤出液，做好标记，4℃或-20℃（短期）保存备用，-70℃长期保存。
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