（2）核酸检测：实时荧光定量PCR（qPCR）方法检测猴痘病毒核酸（PCR 实验室进行）。 ①反应体系的准备：每孔20μL，加入5μL 样本DNA，共计25μL；每次PCR 反应，除检测标本外，应加无DNA 对照（用水代替DNA）、阳性对照；所有样本，包括对照，应设复孔。 ______________________________________________________ 试剂 体积（μL） 终浓度 ______________________________________________________ 灭菌去离子水 6 —— 2×Mix master 12.5 1× 正向/反向引物(5μM) 1 0.4μM 探针(10μM) 0.5 0.2μM DNA模板 5 —— ______________________________________________________ 合计 25 —— ______________________________________________________ ②加样: 每根反应管中加入核酸或对照各5uL，盖紧管盖或封好透明膜，置于荧光定量PCR 检测仪上。 ③扩增条件设定： ____________________________________________________ 循环类型 温度（℃） 时间(分:秒) 循环数 ____________________________________________________ 预变性 95 5:00 1 ____________________________________________________ 变性 95 0:15
扩增—————————————————————40 退火/延伸 60 0:40 _____________________________________________________ ④仪器检测通道选择:使用荧光定量PCR 检测仪，选择Fam荧光信号检测通道，收集设在60℃。具体设置方法参照各仪器使用说明书。 ⑤结果分析阈值设定:使用荧光定量PCR 检测仪进行结果分析时，基线取3-10 或6-15 个循环的荧光信号，阈值设定原则为阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线最高点，也可根据仪器噪音情况调整阈值。 （3）核酸检测结果判断 ①Real-time PCR 反应系统的质量控制:反应结果应同时符合以下2 个条件，否则试验结果无效，应重新开展检测。阴性对照无扩增，为阴性。阳性对照未出现阴性结果。 ②结果判定： A.阴性：双孔Ct 值＞37，或无Ct 值； B.灰区：一孔Ct 值＞37； C.阳性：双孔Ct 值＜37。 所有阳性和处于灰区的标本应重复检测或经序列分析进行确诊。需注意：当标本仅为咽拭子或血清、血浆，且检测结果为阴性时，应结合临床症状，慎重做出阴性诊断。 （4）表格记录 做好荧光定量实时PCR 方法检测猴痘病毒核酸原始记录。
五、猴痘病毒全基因组测序 1.测序标本选取原则。本土疫情中的首发或早期病例、与早期病例有流行病学关联的关键病例、感染来源不明的本土病例、境外输入病例阳性标本等。以上标本在核酸荧光定量PCR检测Ct 值≤32 时进行测序（关键样本除外）。 2.测序要求。以省为单位确定开展猴痘病毒全基因组测序的机构。建议使用扩增子技术进行猴痘病毒全基因组测序。测序数据经质控合格后方可用于后续生物信息分析。二代测序平台覆盖深度应不低于10×，三代测序平台覆盖深度应不低于50×，全基因组测序覆盖度应不低于98%。数据比对分析推荐参考猴痘基因组NC_063383.1。 各省应建立本省输入、本土病例猴痘病毒基因组数据库，应具备序列对比分析能力。具备测序条件的省份要在接收标本后48 小时内开展测序工作，关键样本要求实验室收到标本后1周内提供测序结果报告，所有测序原始数据(一般为fastq 格式)、组装序列（一般为fasta 格式）和标本序列测定结果报告单（见附件7-2）应在获得序列48 小时内报送中国疾控中心病毒病所进行序列汇总、分析。病毒病所应将序列分析结果及时反馈各省，并将全国猴痘病毒序列汇总、分析结果及时上报国家疾控局。 3.分子分型。推荐使用在线分析工具Nextclade（https://clades.nextstrain.org）对变异株进行分子分型。
附件：7-1 猴痘病毒检测标本送检表
7-2 猴痘病毒标本序列测定结果报告单 |
