6.3.1淀粉酶酶解 6.3.1.1酶解条件1(适用于不含抗性淀粉的试样) 热稳定a-淀粉酶酶解:向高脚烧杯中加人50μL热稳定a-淀粉酶液,缓慢搅拌,加盖铝箔,置于95℃~100 ℃的恒温振荡水浴箱中,当温度升至95℃开始计时, 振摇反应35 min。将烧杯取出,冷却至60℃，,打开铝箔盖,用刮勺将烧杯内壁的糊状物以及烧杯底部的胶状物刮下,用5mL50mmol/I顺丁烯二酸缓冲液冲洗烧杯璧和刮勺。 注:为帮助淀粉分散,可适当加入10 mL-15 mL二甲基亚砜。 淀粉葡糖苷酶酶解:向高脚烧杯中边搅拌边加入100 μL淀粉葡萄糖苷酶液,盖上铝箔,继续置于60 ℃士1 ℃水浴中,当水温至60 ℃时计时,振摇反应30 min。 6.3.1.2 酶解条件2(适用于所有试样) 向高脚烧杯中加人5 mL胰a-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶混合酶溶液,缓慢搅拌,加盖铝箔,置于37℃的恒温振荡水浴箱中持续振摇，当温度升至37 ℃开始计时,酶解16 h。 注:如采用高浓度混合酶溶液,酶解时间可适当缩减,不少于4 h。 打开铝箔盖,向试样溶液中加人3.0 mL 0.75 mol/I Tris溶液,使试样溶液pH至8.2士0.2。盖上铝箔,置于95 ℃~100 ℃水浴箱中水浴加热约20 min, 不时轻摇烧杯。取出烧杯冷却至60℃士1 ℃。 6.3.2蛋白酶酶解 向每个烧杯中加入100 μL蛋白酶溶液(如为动物性食品加入500 μL蛋白酶溶液),盖上铝箔,置于60℃士1℃水浴中持续振摇30 min。 打开铝箔盖,边搅拌边加人4 mL.2 mol/L乙酸溶液，用1 mol/L氢氧化钠溶液或1 mol/L 盐酸溶液调pH至4.3士0.2。 注:一定要在60℃士1℃调pH,因为温度降低会使pH升高。注意空白样的pH测定,保证pH在适宜范围内。 6.3.3加入内标溶液 如测定SDFS,向酶解液中加人2 mL 100 mg/mL二甘醇内标溶液,混匀。 6.4总膳食纤维(TDF)的测定 6.4.1 沉淀 向试样酶解液中,加入4倍体积已预热至60℃士1℃的95%乙醇。取出烧杯,盖上铝箔,室温条件下沉淀1 h~2 h。 6.4.2 抽滤 取已处理的坩埚,用15 mL 78%乙醇润湿硅藻土并展平,接上真空抽滤装置,抽去乙醇使坩埚中硅藻土平铺于滤板上。将试样乙醇沉淀液转移人坩埚中抽滤,用刮勺和78%乙醇将高脚烧杯中所有残渣转至坩埚中,用15 mL 78%乙醇洗涤残渣2次。收集滤液转移至500 mL容量瓶中,使用78%乙醇定容至刻度,用于SDFS的测定,残渣用于IDF和SDFP的测定。 6.4.3残渣测定 6.4.3.1 残渣质量:残渣分别用15 mL 95%乙醇洗涤2次,15 mL丙酮洗涤2次,抽滤去除洗涤液。将坩埚连同残渣置于烘箱内于105℃士2℃烘干过夜。将坩埚转移至干燥器内冷却1 h,称量包括坩埚质量及残渣质量(mGR),精确至0.1mg,减去坩埚质量,计算试样残渣质量(mR)。 6.4.3.2 蛋白质和灰分的测定:取1份试样残渣参照GB 5009.5测定蛋白质含量(mP),折算系数为6.25。 取另一份试样参照GB 5009.4测定灰分含量,即在550℃士25℃灰化4 h后转至干燥器中,冷却后精确称量坩埚及残渣总质量(mGA),精确至0.1 mg,减去坩埚质量,计算灰分质量(mA)。 6.4.4 SDFS的测定 注:无添加膳食纤维组分的试样,由于大部分植物性食品及其制品SDFS含量较低,因此测定TDF时也可不包含SDFS部分。 6.4.4.1 浓缩:取200 mL滤液至旋转蒸发瓶中,于50℃水浴减压蒸发至近干。 6.4.4.2复溶:量取20mL水加人旋转蒸发瓶中,溶解残留物形成复溶液。 6.4.4.3 脱盐:取15 mL带盖聚丙烯管,预先装填阴离子交换树脂(OH- )和氢离子交换树脂(H+ )各2 g;取5 mL复溶液加至聚丙烯管中,旋紧盖子反复颠倒混合5 min以上进行脱盐,静置沉淀10 min,将上清液转移至15 mL带盖聚丙烯管中;向沉淀物中加人5 mL水,旋紧盖子反复颠倒混匀,静置5 min以上,合并上清液,混合后经0.45μm滤膜过滤，上机待测。 6.4.4.4色谱参考条件 色谱参考条件如下: a)色谱柱:高效水相体积排阻(SEC)凝胶色谱柱,以亲水性球形多孔聚甲基丙烯酸酯型高聚物作为填料,孔径小于20 nm,柱长300 mm,内径7.8 mm,粒径7 μm,或等效柱,两根凝胶色谱柱串联; b) 保护柱:高效水相体积排阻(SEC)凝胶保护柱,填料与色谱柱相同,柱长40 mm,内径6.0 mm,粒径12 μm; c) 流动相:水(一级水); d) 柱温:80℃ ; e) 检测器温度:50 ℃°C ; f) 进样量:20 μL; g) 流速:0.5 mL/min; h) 洗脱时间:60min。 6.4.4.5 SDFS保留时间的确定:取定性标准溶液上机测定,至少平行测定2次。根据蔗果三糖和D-麦芽糖保留时间和基线分离效果，确定碳水化合物聚合度≥3与聚合度<3的分界值、待测组分保留时间区间。色谱图可参考附录B。 6.4.4.6 D-葡萄糖响应因子(Rf )的确定:取D-葡萄糖/二甘醇标准系列工作液上机测定。以标准系列工作液中D-葡萄糖质量与二甘醇质量比值为横坐标，以D-葡萄糖峰面积与内标二甘醇峰面积比值为纵坐标.绘制过(0,0)点标准曲线.曲线斜率即为响应因子(Rf)。 6.4.4.7 SDFS测定:取脱盐后试样液，上机测定，根据聚合度≥3聚合物峰面积(PASDFS)和二甘醇峰面积(PArs)计算SDFS含量。 6.5不溶性膳食纤维(IDF)的测定 6.5.1 按6.2称样,按6.3酶解。 6.5.2 抽滤:取已处理的坩埚,用3 mL水润湿硅藻土并展平,抽去水分使坩埚中的硅藻土平铺于滤板上。将试样酶解液全部转移至坩埚中抽滤,残渣用10 mL 70℃热水洗涤2次,用于IDF的测定。 6.5.3 残渣测定:按6.4.3操作。 6.6 可溶性膳食纤维(SDF)的测定 6.6.1 按6.2称样，按6.3酶解。 6.6.2 按6.5.2抽滤。 6.6.3 收集滤液:收集滤液至另一已预先称量的600 mL高脚烧杯中,称量“烧杯十滤液”的总质量,扣除烧杯质量,估算滤液体积。 6.6.4 沉淀:按乙醇与滤液体积4 : 1的比例加入预热至60℃士1℃的95%乙醇,盖上铝箔,室温下沉淀1h以上。 6.6.5 再抽滤:按6.4.2操作。滤液用于SDFS的测定,残渣用于SDFP的测定。 6.6.6 测定:残渣按6.4.3 测定SDFP;滤液按6.4.4测定SDFS。SDFP与SDFS之和为可溶性膳食纤维。 注:未添加膳食纤维组分的试样,可溶性膳食纤维中可不包含SDFS部分。
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