佐剂-抗原结合可以是半成品配制前的独立工序（如，首先形成单价吸附原液），也可以与半成品配制过程同时进行。 佐剂-抗原吸附生产方式主要采用抗原与制备完成的铝佐剂（预制或外购）进行吸附，需要研究并明确的吸附工艺参数可能包括：抗原浓度、铝浓度、吸附的缓冲体系、盐离子浓度、PH值、加样顺序、加样速度、吸附时间、温度、搅拌时间、搅拌速度等。 佐剂-抗原吸附也可采用原位吸附。由于原位吸附工艺涉及佐剂、佐剂-抗原复合物的同时生成和控制，难以分步进行工艺表征和生产过程控制，因此，如拟采用原位吸附工艺方式，应提供充分的选择依据。原位吸附的工艺开发和过程控制除前述吸附工艺参数外，还需关注更多影响抗原-佐剂结合的工艺操作参数，如，洗涤缓冲液类型、沉淀和洗涤液比例、洗涤次数等。此外，在工艺开发和表征过程中，建议关注原位吸附化学反应局部放热对抗原-佐剂结合物质量属性及免疫原性的影响。 建议在制剂处方研究、吸附工艺研究及吸附工艺验证中开展抗原-佐剂吸附动力学的研究。通过动力学研究确定结合速度及吸附的工艺条件（如，pH、离子强度、缓冲系统、佐剂和抗原配比、吸附时间和吸附温度等）。在工艺验证过程中通过对吸附动力学的研究对工艺性能进行进一步确证。鼓励采用新技术进行相关研究。 在工艺确认的基础上，应识别吸附及配制关键工艺步骤，建立适宜的过程控制策略，确保工艺一致性[10]。 抗原和佐剂吸附后的单价吸附原液等产物可作为中间产品在适当条件下保存，后续进行制剂配制和灌装。应对含铝佐剂疫苗灌装工艺进行充分的研究，如，灌装前中间产物的重悬条件、灌装期间产品均一性的保持条件（包括连续灌装和意外情况下的中断等），建立明确、可控的灌装工艺参数，进行充分验证以保证灌装成品的均一性。 应明确中间产品的保存阶段、保存条件和保存时间[2]。应对中间产品开展充分的稳定性研究。 2.佐剂-抗原结合物质量特性研究 整体上，应评价佐剂和抗原之间、佐剂之间（如使用佐剂系统）的相容性和干扰[4]。对于佐剂-抗原结合物质量特性研究一般需关注： 佐剂-抗原结合水平及其一致性，如，吸附后及整个货架期的佐剂-抗原吸附率、吸附强度及其保持状态等。 吸附前后结合物中的抗原完整性，如，吸附前后及解吸附后抗原结构变化，吸附后的抗原聚集，吸附对蛋白抗原和多糖抗原稳定性（降解）的影响，吸附对佐剂-抗原复合物其他的理化特性影响研究，如，粒径等理化参数[2]。鼓励采用先进的技术方法研究吸附对抗原结构的影响[14]。 佐剂-抗原复合物的生物学活性（采用生物学方法的检测）是最关键的综合性指标，尤其是在无法完全理解佐剂疫苗组分/理化特性与疫苗免疫原性/有效性相关性的情况下，可作为理化特性研究的补充，如进行体内/体外效力研究，进行总抗原/游离抗原含量及吸附强度对效力的影响研究等。 如果疫苗是采用与佐剂预混合后共同包装的，应进行成品的效力检测；如果抗原组分、佐剂组分采用了单独包装，除进行吸附后的成品效力检测外，还需进行吸附前抗原中间产物的效力和抗原含量检测。 3.佐剂-抗原结合物的稳定性研究 佐剂-抗原结合物、成品的稳定性研究可参照《生物制品稳定性研究指导原则》，并根据产品自身特点结合保存、包装和运输的情况设计合理的研究方案。 货架期抗原解吸附可能会对产品的免疫原性和安全性带来影响。因此，除常规放行指标外，佐剂-抗原结合物的稳定性研究应特别关注抗原从佐剂上解离的程度、抗原降解及完整性（如抗原分子量变化、游离多糖变化）[2，16]、效力等方面的考察。 可参照《化学药品注射剂与药用玻璃包装容器相容性研究技术指导原则（试行）》[17]、《化学药品与弹性体密封件相容性研究技术指导原则（试行）》[18]对选择的包装容器和密闭系统进行评估和相容性研究。 在联合疫苗的开发过程中，应研究佐剂与其他组分间的相容性及对每一成分的药效和稳定性的影响，从而确定组分的包装形式，如，单一包装还是组合包装。 （四）放行质量标准 1.检测项目 根据疫苗的组分组成、生产工艺等具体情况，佐剂-抗原结合物的质控可能包括吸附前中间产物的控制、吸附单价原液（如有）、半成品和成品的质量控制，上述各个阶段的检测是保证最终疫苗成品质量的必要基础，但具体检测阶段的检测项目可根据各个阶段的检测项目要求、检测方法的可行性、批签发要求综合考虑，一些在成品无法检测的项目（如纯度、杂质残留等）可在早期阶段进行检测。对吸附后产物的质控一般包括以下几个阶段： （1）单价吸附原液 单价吸附原液质控指标可能包括但不限于抗原含量、蛋白含量、吸附率、佐剂含量、pH值、细菌内毒素、无菌等检定项目。 （2）半成品 半成品检定一般应至少包括无菌试验，对于佐剂含量、吸附率等检定项目，可在成品中予以检定。 （3）成品 成品质控指标通常包括体内效价、体外效价、吸附完全性试验及药典要求的其他必要项目。 2.检测方法 铝佐剂吸附对于抗原组分检测将产生特定的影响，应研究配制后相关的检测方法和检测结果是否会受到影响[19]，一些特殊的关注点列举如下： 铝吸附后成品无法准确的进行一些工艺相关杂质的检测，如，残留DNA、宿主细胞蛋白等。应在适宜的敏感步骤予以检测。 铝吸附后成品的一些检测项目（如，体外效价检测等）往往需要进行解吸附的处理，需要进行相应的方法学研究和方法学验证。解吸附方法建立在对抗原佐剂吸附机制的理解基础之上，应选用适宜、可行的解吸附方法，方法学验证应包括解吸附过程对抗原构象的影响、解吸附后的抗原回收率等研究。 对于含铝佐剂的疫苗，成品体外效力试验主要反映抗原对成品效力的影响，因此，通常成品应进行佐剂含量检测、吸附率检测及体内效力检测。上市后可通过足够批次的体内和体外效力数据及其与临床批次的对比分析，评价体外效力代替体内效力的可行性。 本原则应与《联合疫苗临床前和临床研究技术指导原则》联合考虑。 联合疫苗可包含多种佐剂-抗原结合物，其制剂研发应综合考虑抗原、佐剂、缓冲体系、辅料的相容性以及对检测方法的影响等多个方面。应研究佐剂与其他组分间的相容性及对每种组分的吸附能力。考虑多个组分同时吸附时的吸附效率和动力学[16]。若有配制前不进行吸附的抗原组分，需评估佐剂对这种非吸附抗原的影响（如配制后是否会被吸附）、以及这种非吸附抗原对佐剂-抗原复合物的影响（如已吸附的组分在配制后是否有解吸附）[2，16]。联合疫苗制剂的研发过程中，需选用对各个抗原-佐剂吸附产物均适用的缓冲体系。建议采用矩阵分析的方法，研究不同制剂处方对于各个抗原的吸附、竞争以及相互作用等方面，可能产生的影响。 联合疫苗生产过程中不同抗原成分的混合策略主要有共同吸附、顺序吸附、平行分别吸附，需根据工艺可控程度和抗原竞争程度选择适宜的混合策略，以保证联合疫苗各抗原较好的免疫原性及生产的可重复性。 |
