（四）色谱法 色谱法又称层析法，是一种物理或物理化学分离分析方法，也是中药化学成分分离和鉴别的重要方法之一。其基本原理是利用物质在流动相与固定相两相中的分配系数差异而被分离，当两相相对运动时，样品中的各组分，将在两相中多次分配，分配系数大的组分迁移速度慢，反之迁移速度快而被分离。根据色谱分离原理，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱等。根据流动相与固定相的分子聚集状态及操作形式进行分类，可分为纸色谱法、柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、蛋白电泳色谱法、毛细管电泳法等。现仅就常用的后五种方法简介如下： 1.薄层色谱法 系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物(对照品或对照药材)按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。薄层色谱法因其快速、简便和灵敏，是目前中药鉴定中用于定性鉴别使用最多的色谱法之一。 薄层色谱法既可作定性鉴别，又可作含量测定。用于主成分含量测定具有用量少、方法简便的特点。除刮取薄层上主要成分斑点，经溶剂洗脱后进行测定外，也可在薄层板上直接测定含量。如薄层扫描法。 2010年版《中国药典》收载了薄层-生物自显影技术的鉴别新方法，本法是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的鉴别中药的方法。是利用薄层板将中药提取物在薄层板上展开后，浸以具有含有生物活性的显色剂或与接种了病原微生物(人体致病菌或植物致病菌)的培养基相接触，通过显色或微生物的培养，鉴别具有活性的化学成分斑点，从而达到鉴别药材的一种新技术。薄层-生物自显影技术具有操作简单、耗费低、灵敏度和专属性高等优点，是一种快速将生物活性与中药鉴定相结合的方法，可用于对具有抗菌、抑制胆碱酯酶，以及清除自由基和抗氧化等活性的中药的鉴别。《中国药典》2010版一部地黄、熟地黄就采用了薄层-生物自显影技术，以具有抗氧化活性的毛蕊花糖苷为对照品，采用了具有自由基的显色剂2，2-二苯基-1-苦肼基无水乙醇浸渍薄层板后展开，如展开后斑点具有抗氧化活性，则颜色发生变化，从而鉴别地黄和熟地黄药材。 2.气相色谱法 系采用气体为流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。被测物或其衍生物汽化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。所用的仪器为气相色谱仪，由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成。①载气源：氦、氮和氢可用作载气，除另有规定外，常用的载气为氮气。②进样方式：一般可采用溶液直接进样或顶空进样(适用于固体)。③色谱柱：为填充柱或毛细管柱。④柱温箱：其波动会影响色谱分析结果的重现性，因此柱温箱精度应在±1℃。⑤检测器：有火焰离子化检测器(FID)、热导检测器(TCD)、氮磷检测器(NPD)、火焰光度检测器(FPD)、电子捕获检测器(ECD)、质谱检测器(MS)等。火焰离子化检测器对碳氢化合物响应良好，适合检测大多数的药物。气相色谱法最适用于含挥发油及其他挥发性成分的药材及中成药的分析，用于药品的鉴别、杂质检查、水分测定、农药残留量测定和含量测定。如对三种砂仁(阳春砂 Amomum villosum Lour.、绿壳砂A.villosum Lour.var.xanthioides T.L.Wu et Senjen和海南砂A.longiligulare T.L.Wu)挥发油进行气相色谱测定，可以看出三种来源砂仁均含有柠檬烯、芳樟醇、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯等主要成分，但含量不同，其他色谱峰亦有明显区别，可以区分三种砂仁。 3.高效液相色谱法 系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。①色谱柱：最常用的填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用；正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。②检测器：最常用的是紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他还有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。③流动相：反相色谱系统的流动相首选甲醇或乙腈-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。④系统适用性试验：通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更重要的参数。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、灵敏度和准确度高、重现性好、专属性强等特点，因该法不受样品挥发性的约束，对低挥发性、热稳定性差、高分子化合物和离子型化合物均较适合，现已成为中药含量测定方法的首选和主流。如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生素以及无机盐类等都可利用高效液相色谱法进行分离和分析。如2015年版《中国药典》应用高效液相色谱法，建立了沉香对照药材特征图谱，其呈现6个特征峰，通过供试品色谱峰与对照药材特征图谱对比，从而达到鉴别目的。 高效液相色谱比气相色谱有适用范围广、流动相选择性大、色谱柱可反复应用，以及流出组分容易收集等优点，现已广泛用于中药材和中成药的质量分析。 4.毛细管电泳色谱法 毛细管电泳又称高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)是近几年分析化学中发展最为迅速的领域之一，具有色谱和电泳两种分离机理，是依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。高效毛细管电泳是在很细的毛细管(直径一般在25～75μm)中两端施加直流高压电场(可高达75kV，一般使用30kV)，组分在管中根据其所带电荷、分子量大小以及与柱内填充物的作用，产生不同的迁移速度，从而对各组分进行分离。由于毛细管具有良好的散热效能，允许在其两端施加高压，因而分离操作可在很短的时间内完成(多数<30分钟，最快只用几秒)，达到非常高的分离效率(N达到105～106)。毛细管内径很小，与传统的电泳相比，毛细管电泳的优势在于：高效、快速、微量、可自动化。与高效液相色谱(HPLC)相比，它们的分离机理不同，在选择性方面HPLC与HPCE可以互为补充，但是，无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势。HPCE有多种分析模式，毛细管区带电泳(CZE)、毛细管胶束电动色谱(MECC)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管等电聚焦电泳(CIEF)、毛细管凝胶电泳(CGE)等分别适用于各种不同性质物质的分离。具有高效、低耗、用样少、应用范围广的优点，发展极快，已在多肽、蛋白质、核酸、手性化合物等生物活性物质分离、DNA序列和DNA合成中产物纯度的测定以及单个细胞和病毒分析等方面得到广泛应用。在中药鉴定、生物分析及生命科学领域中有着极为广阔的应用前景。
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