5.蛋白电泳色谱法 利用中药含有蛋白质、氨基酸等带电荷的成分，在同一电场作用下，由于各成分所带电荷性质、数目及分子质量不同，因而泳动的方向和速度不同，在一定时间内，各成分移动距离不同，出现谱带的条数不同而达到分离鉴定的目的。本法适用于动物类药和果实种子类药的鉴别。目前常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳是指以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳分离方法。按其分离原理可分为连续缓冲系统和不连续缓冲系统两种；按其实验所用仪器及操作方法又可分为圆盘型和平板型两种。基本实验步骤：①样品制备及凝胶系统的选择；②加样与电泳；③固定、染色、脱色、取出凝胶；④分析电泳谱带。该法较适于蛋白质、氨基酸等成分的分析与鉴定。许多中药材含蛋白质及氨基酸，特别是动物类中药和果实种子类中药。电泳在中药分析中的应用实例很多，已用该法成功地进行真伪鉴别。如蛇类药材及其伪品，西洋参、人参及其伪品，山药及其伪品的鉴别等。现就西洋参、人参及其伪品的鉴别方法详述如下：①样品制备及凝胶系统的选择：药材趁鲜切片，低温干燥(温度<60℃)，捣碎，过40目筛，取样品粉末各0.5g，冰箱内固定1小时，加电极缓冲液2mL研磨成匀浆状，转移至离心管中，3500rpm离心10分钟，上清液再以5000rpm离心10分钟，备用。凝胶：分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为2.5%。电极缓冲液为Tris-甘氨酸pH=8.3的缓冲液。②加样与电泳：每凝胶管加样品液100μL，表面小心覆盖电极缓冲液，上槽负极缓冲液中加2滴溴酚蓝指示剂。接通电源，并调节电流至每管1mA，当样品液进入分离胶后(约20分钟)，加大电流至每管2mA。待溴酚蓝行至距末端1cm时，停止电泳。③固定、染色与脱色：电泳完毕后，取出凝胶，于12.5%三氯乙酸中固定30分钟，然后浸入含2%的考马斯亮蓝R250的12.5%三氯乙酸中染色2小时，再用7%醋酸漂洗脱色至背景清晰为止。④结果：电泳谱带根据染色深浅可分为四级，色深者为一级带，色浅者为二级带，色极浅者为三级带，谱带扩散者为扩散带(图4-2)。
图4-2 西洋参、人参及其伪品的电泳 1.人参 2.西洋参 3.桔梗 4.沙参 5.蔓生百部 6.紫茉莉 7.商陆 （五）光谱法 光谱法是通过测定物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。一般常用波长为：紫外光区200～400nm，可见光区400～850nm，红外光区2.5～15μm(或按波数计为4000～667cm-1)。所用仪器为紫外分光光度计、可见分光光度计(或比色计)、红外分光光度计和原子吸收分光光度计。 1.紫外-可见分光光度法 对主成分或有效成分在200～760nm处有最大吸收波长的中药，常可选用此法。测定样品时，所用溶剂在所测定波长附近应无吸收，不得有干扰吸收峰。测定时一般应以配制样品的同批溶剂为空白。所配样品溶液的吸收度读数以在0.3～0.7之间误差较小。 紫外分光光度法不仅能测定有色物质，对有共轭双键等结构的无色物质也能精确测定，具有灵敏，简便，准确，既可作定性分析又可作含量测定等优点，适用于大类成分的含量测定，如总黄酮、总生物碱、总蒽醌等。目前紫外分光光度计的种类较多，且在测定技术上摆脱了纯化合物的框框。中药材紫外吸收光谱是各组分特征吸收光谱叠加而成，在一定条件下，同一种药材应有相同的紫外吸收光谱。因此，该法比其他光谱法，如红外、核磁共振谱等有更广泛的用途。紫外分光光度法在中药鉴别中应用实例很多，如人工牛黄的三氯甲烷提取液，在453nm处有最大吸收，从而鉴别药材。 可见分光光度法是比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。在可见光区400～850nm，有些物质对光有吸收，有些物质本身并没有吸收，但在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后，可用此法测定。显色时由于影响呈色深浅的因素较多，所以测定时需用标准品或对照品同时比较。常使用的仪器为可见分光光度计。比色法多用于中药的定量分析及物理常数的测定。 2.红外分光光度法 是鉴别化合物和确定物质结构的常用手段之一。在药物分析中，以红外光谱具有的“指纹”特性作为药物鉴定的依据，是各国药典共同采用的方法，但通常仅限于西药等单组分、单纯化合物的鉴定。由于中药材、中药饮片和中成药是许多成分的混合物体系，它们的红外光谱是组成它们的所有化合物的红外光谱的叠加。中药的正品与伪品，不同产地、不同生境的药材，栽培品与野生品，只要药材中所含的化学成分不同或各成分含量的比例不同，就可导致红外光谱的差异，凭借红外光谱图的这些差异特征，如峰位、峰强度和峰(或谱带)形状特征，可以用来鉴别中药的真伪优劣。关于红外光谱的标准图谱已有文献资料、专著可供查阅，如卫生部及药典委员会编订的《药品红外光谱集》，矿物类中药的红外光谱等。此外，还出版了专著《中药二维相关红外光谱鉴定图集》，其中包括280种中药材，5种伪品药材，4种不同产地的药材，30种配方颗粒和10种中药注射剂干燥物的红外光谱图、二阶导数谱和二维相关红外光谱，对数量众多的中药材和中成药进行了分类识别与鉴定。 红外光谱直接用于中药材粗提物品种鉴别的报道多见，除矿物类中药直接压片有专著介绍外，还有珍珠、蟾酥、哈蟆油、五灵脂、麝香、牛黄、血竭等植物药可以直接压片鉴别真伪。把植物药分别用脂溶性提取物和水溶性提取物进行红外光谱分析，实验结果证明，不同品种均具有较高的特征性和可重复性，通过药材的粗提物，完全能对同属不同种的药材进行鉴别。如将六种贝母分别用95%乙醇回流提取1小时，提取物浓缩蒸干，与溴化钾粉混合压片，测定红外吸收光谱，结果说明六种贝母之间均有差异。又如血竭及其掺杂品的红外光谱，血竭的红外吸收峰是1120、1610cm-1，以1610cm-1为特征吸收峰；达马胶的红外吸收峰是1380、1460、1707cm-1，以1707cm-1为特征吸收峰；松香的红外吸收峰主要是1692cm-1，还有1280cm-1。两种不同规格的血竭，其红外光谱血竭的特征吸收峰一致，同时均有达马胶特征吸收峰，这表明加工血竭中掺入了达马胶(图4-3)。
图4-3 血竭及其掺杂品的红外光谱 A.手牌血竭 B.皇冠牌血竭 C.进口达马胶 D.松香 |
