3.原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法的测量对象是呈原子状态的金属元素和部分非金属元素，系由待测元素灯发出的特征谱线通过供试品经原子化产生的原子蒸气时，被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，通过测定辐射光强度减弱的程度，求出供试品中待测元素的含量。通常通过比较标准品溶液和供试品溶液的吸光度，求得供试品中待测元素的含量。本法的特点为专属性强，检测灵敏度和精密度均高，测定速度快，是目前用于测定中药中重金属及有害元素、微量元素最常用的方法。测定方法分为标准曲线法和标准加入法。所用仪器为原子吸收分光光度计，由光源、原子化器、单色器、背景校正系统、自动进样系统和检测系统等组成。测定中药中微量元素的方法，还有原子发射光谱、中子活化分析、离子发射光谱、等离子体吸收、X射线荧光光谱、X射线能量色散分析、荧光光谱、X射线衍射等方法。据报道，应用此法对一百种市售药材的铬、锰、铁、镍、铜等金属元素进行了定量，对鹿茸、大黄等单味药和六味地黄丸等中成药进行了微量元素的定性定量分析。如在分析沙苑子时，发现除钴、镉两元素含量在ppm级以下外，其余7种必需微量元素的含量都在几个至几十个ppm之间，所以认为长期服用沙苑子，可以较全面地为人体提供这些元素。并有报道，应用此法测了六个产地麻黄中8种元素的含量，绘制了微量元素(TE)图谱，这对地道药材和栽培药材的品质评价，具有一定的参考作用。 4.荧光光度法 荧光光度法基本原理是蒸气状态的原子因吸收能量而跃迁至高能态，并在这个过程中发射出具有固定波长的荧光。荧光光度法具有两个特征光谱，即激发光谱与发射光谱。激发光谱是指不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率，发射光谱表示所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。荧光物质的最大激发波长和最大发射波长是鉴定物质的依据，也是定量测定时最灵敏的光谱条件。荧光光谱能形象地反映出荧光组分的各种信息，所有荧光组分的种类和量的信息均反映在光谱上，使得每种中药的荧光光谱有所差异，进一步结合计算机技术，根据一定的标准进行确认，便可达到对中药的识别和质量控制等目的。如利用荧光光谱，对13种不同来源鹿茸样品进行成像分析，获得了各样品的特征荧光光谱曲线，鉴别结果与作为对照实验的性状、显微鉴别结果一致，能够将正品鹿茸与鹿茸伪品、鹿茸碎片和其他物质的黏贴混合物区分开来。表明荧光鉴别具有检测简便、无损、快速和可重复等优点，可作为中药真伪鉴定的依据，且有普遍意义。 荧光光度法最主要的优点是高灵敏度和高选择性。一般紫外-可见分光光度法的灵敏度为10-7 g/mL，而荧光法的灵敏度可达到10-10 g/mL甚至10-12 g/mL，其具有灵敏度高、选择性好、方法简便、重复性好和用样量少等优点，正日益成为分析方法中研究的热点。有学者对中药三维荧光指纹图谱数据库的构建进行了探索，得到了200余种国家标准对照药材的三维荧光光谱，同时设计了检索程序的算法和数据库的结构，在中药材的化学成分尚未完全清楚的时候，使快速地实现对中药的鉴别和质量控制成为可能。 5.核磁共振光谱法 核磁共振光谱法是将有磁矩的原子核放入磁场后，用适宜频率的电磁波照射，原子核吸收能量，从而发生能级的跃迁，同时产生核磁共振信号，得到核磁共振谱。核磁共振光谱主要有核磁共振氢谱(1 H-NMR)和核磁共振碳谱(13 C-NMR)，其中核磁共振氢谱在化学结构及药物分析领域中早已得到广泛的应用，用于中药材的鉴定是近几年发展起来的又一个应用的重要方面。核磁共振氢谱与红外光谱、紫外光谱类似，也属于吸收光谱，其提供的结构信息独具特点，可以获得化合物的包括各类质子的化学位移、数量、偶合关系等结构信息，根据不同中药结构信息的差异，从而应用于中药鉴定中。中药成分复杂，用一定方法得到中药的特征性化学成分(或化学成分组)总提取物，同时这些特征性化学成分的含量是相对固定的，则在规范的提取分离条件下，中药的1 H-NMR图谱与药用植物品种间存在着严格的对应关系。实验研究表明，中药的1 H-NMR图谱具有高度的特征性和重现性，可依照图谱上显示的特征共振信号和数据鉴别中药材。国内学者已成功使用核磁共振氢谱对五加科(人参、西洋参、三七)、蓼科(何首乌、虎杖)及天麻、黄连等药材进行了鉴别。该方法样品用量少，提供信息多，效率高，误差小，结果重现性好，再结合化学计量学方法优化数据，对于中药材的鉴定有着很大的发展应用前景。 （六）色谱-光谱联用法 每一种分析技术均有其适用范围和局限性。如色谱技术分离能力强、检测灵敏度高、分析速度快，是复杂混合物分析的首选技术，但在对未知物定性方面往往难于给出可靠信息。另一类技术，如质谱(MS)、红外光谱(IR)和核磁共振波谱(NMR)等，则具有很强的鉴定未知物结构的能力，却不具有分离能力，因而对复杂混合物无能为力。于是，便出现了将两者长处结合起来的联用技术。事实上，将单一的分析技术联合起来，不仅能获得更多的信息，而且可能产生单一分析技术所无法得到的新的信息。因此，联用技术已成为分析仪器发展的一个重要方向。如气相-质谱(GC-MS)、红外-质谱(IR-MS)、高效液相-质谱(HPLC-MS)、质谱-质谱(MS-MS)等。后者称“串联质谱”，分析时不需要对中药提取分离，可直接以粉末进样，对粉末药材非常适用。气相-质谱与计算机联用，充分发挥了气相色谱的高分离效能和质谱的高鉴别能力的特点，已得到广泛的应用。如辛夷、细辛、牡荆叶、土鳖虫、红娘子等所含挥发性成分的分析，一般都能分析出十多种到数十种单一成分和其含量。对9种辛夷的挥发油成分分析，共鉴定出69种化合物，分别测出了它们的百分含量。这为中药材的品质评价提供了重要依据。 （七）浸出物测定 对某些暂时无法建立含量测定项的中药，或已有含量测定项的中药，为了更全面地控制中药的质量，一般可根据该中药已知化学成分的类别，结合用药习惯、中药质地等，选用适宜溶剂为溶媒，测定中药中可溶性物质的含量，用以控制中药的质量。通常选用水、一定浓度的乙醇(或甲醇)、乙醚作溶剂，用冷浸法或热浸法做中药的浸出物测定。测定用的供试品须粉碎，使能通过二号筛，并混合均匀，按《中国药典》规定的方法进行测定。测定时根据《中国药典》规定的溶剂，或根据已知成分的溶解性质选用溶剂。如2015年版《中国药典》规定降香的乙醇浸出物不得少于8.0%；黄芪的水溶性浸出物不得少于17.0%。 （八）含量测定 中药材含有多种成分，常共具临床疗效，有时甚至具双向调节作用，很难确定某一化学成分即是中医用药的唯一有效成分，有些尚不一定能与中药疗效完全吻合，或不能与临床疗效直观地比较。然而药物有效必定有其物质基础，以中医理论为指导，结合现代科学研究择其具生理活性的主要化学成分，作为有效或指标性成分之一，进行含量测定，鉴定评价中药质量。有效成分或指标性成分清楚的可进行针对性定量；有效成分尚不清楚而化学上大类成分清楚的可对总成分如总黄酮、总生物碱、总皂苷、总蒽醌等进行含量测定；含挥发油成分的可测定挥发油含量。 含量测定的方法很多，常用的有经典分析方法(容量法、重量法)、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层扫描法、薄层-分光光度法等。如2015年版《中国药典》规定，采用容量法测定石膏中含水硫酸钙(CaSO4·2H2O)的含量不得少于95.0%；采用重量法测定芒硝中硫酸钠(Na2 SO4)的含量不得少于99.0%；采用分光光度法测定人工牛黄中胆酸(C24 H40 O5)的含量不得少于13.0%；采用气相色谱法测定丁香中丁香酚(C10 H12 O2)的含量不得少于11.0%；采用高效液相色谱法测定人参中的人参皂苷Rg1(C42 H72 O14)和人参皂苷Re (C48 H82 O18)的总量不得少于0.30%，人参皂苷Rb1不得少于0.20%。 含挥发油类、脂肪油类、树脂、蜡的药材，除进行油、脂、蜡等含量测定外，尚需进行物理常数和化学常数测定，如羟值、酸值、皂化值、碘值等，以表示药材品质的优劣度。 挥发油含量测定是利用药材中所含挥发性成分能同水蒸气同时蒸馏出来的性质，在挥发油测定器中进行测定。《中国药典》2015年版四部，挥发油测定法分甲法和乙法，甲法适用于测定相对密度在1.0以下的挥发油，乙法适用于测定相对密度在1.0以上的挥发油。如《中国药典》2015年版中规定，八角茴香中含挥发油的含量不得少于4.0%(mL/g)。具体仪器装置及方法详见《中国药典》附录。 当采用《中国药典》方法测定挥发油含量少于0.1%的中药时，当常用样品量无法测定时，有人提出用吸香-色谱联用技术。即先使中药中具升华性或挥发性成分充分地被油脂吸收，然后用适当的溶剂提取，经色谱分析，可以有效地进行定量分析。此法灵敏度高，中药中仅含万分之几的挥发油成分也可进行测定。 （九）指纹图谱测定 中药指纹图谱是借鉴了法医学指纹鉴定的概念，但不是概念的重复。中药指纹图谱是指某种(或某产地)中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱、光谱、DNA分子的图谱。其指纹图谱涉及范围广泛，不单纯是化学成分的指纹图谱，尚包括DNA分子的指纹图谱，本章重点讲述化学成分的指纹图谱。 其特点是：①通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地。②通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保样品质量的相对稳定。中药指纹图谱系指中药原料药材、饮片、半成品、成品等经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其特征的共有峰的图谱。中药指纹图谱能客观地揭示和反映中药内在质量的整体性和特征性，用以评价中药的真实性、有效性、稳定性和一致性。 中药的临床疗效并非由单一活性成分的作用或多种活性成分作用的简单相加，特别是复方制剂更是如此。故用已知某一个或几个活性成分或有效成分为质量指标，通过定性和定量分析来判断药品质量的优劣，显然是不全面的。中药质量的评价需要综合的、宏观的、非线性的质量评价体系，中药指纹图谱就是能较好地适应这一特点的一种质量评价与控制模式。在国际上，如日本、德国、英国、法国、美国、加拿大、印度等许多国家，对一些传统药、天然药和草药，都把指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。 国家食品药品监督管理局在2000年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)，2002年又颁布了《中药注射剂指纹图谱实验研究技术指南》和两个“计算机辅助中药指纹图谱相似度计算软件”。详细规定了原料药材、半成品、成品的供试品收集与制备及制订指纹图谱的各项技术要求： (1)供试品的收集 化学成分稳定的中药材是制定合格的中药指纹图谱的物质基础，特别在制定中药材的指纹图谱中，极为重要。《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》中规定应收集不少于10批供试品，且动、植物药材均应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法，矿物药应固定产地和炮制、加工方法，这些是制定合格指纹图谱的先决条件。 (2)检测方法 适宜的检测方法是制定合格指纹图谱的重要环节，应根据供试品的特点和所含化学成分的理化性质，选择相应的检测方法，说明该检测方法的依据和原理，并附该检测方法的方法学考察(包括稳定性、精密度和重现性等)资料和相关图谱。挥发性成分采用气相色谱检测较易达到要求；非挥发性成分采用高效液相色谱检测较易达到要求；对于一些成分简单、在薄层色谱上分离度较好的供试品，则可采用薄层扫描法。以色谱方法制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定。而光谱方法由于提供信息较少，或同类化合物其取代基的变化难以在光谱中体现出来，因此较少采用。要求色谱指纹图谱必须有良好的专属性、重现性和可行性。 (3)参照物和供试品的制备 对药材和复方制剂君药的活性成分或指标性成分，应尽量选择对照品作为参照物，既可以作为相对保留时间计算的参照物，又可以作为峰面积比值计算的参照物，同时又能初步了解指纹图谱中各色谱峰成分的性质。而采用内标物作为参照物，由于指纹图谱色谱峰的复杂性，较难选择合适的内标物插入图谱中。供试品的制备应进行适当的纯化，以便得到分离度较好的指纹图谱，但纯化方法应力求最大限度地保留供试品中的化学成分。 (4)指纹图谱的技术参数 采用高效液相色谱法和气相色谱法制定指纹图谱，其指纹图谱的记录时间一般为1～2小时；采用薄层扫描法制定指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。对于成分复杂的中药材，必要时可以考虑采用多种测定方法，建立多张对照指纹图谱。在标定共有峰时，应选择10批次以上供试品中都出现的色谱峰作为共有峰。共有指纹峰面积的比值，是以对照品作为参照物，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物指纹峰面积的比值，各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。峰面积不能太小，若峰面积太小，如果仪器的检测灵敏度发生变化，有可能使该峰丢失。非共有峰的标定，应根据10批次供试品检测结果，标定不能在每批供试品中都出现的色谱峰作为非共有峰，非共有峰的总面积不得大于总峰面积的10%。 此外，还有X射线衍射分析法、差热分析法、计算机图像分析法、模式识别法等先进技术和方法应用于中药鉴定，将对中药的现代分析起到推动作用。
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