五、生物鉴定 生物鉴定(Bioassay)是近年来兴起的一种中药品质鉴定新方法，它与经典的基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定一起，并称为中药的五大鉴定。生物鉴定具有先进性、适用性、可操作性以及专属性强、重现性好等特点，并且能够突出中药的药效学作用，准确性高。 生物鉴定是利用中药或其所含的药效组分对生物体的作用强度，以及用生命信息物质特异性遗传标记特征和基因表达差异等鉴定中药。也就是通过对生命信息物质(核酸、蛋白质等)的识别或对中药所含化学物质的生物效应(药效、活力或毒力)测定，来鉴定中药的品种和质量。常用的方法有分子生物学鉴定、细胞生物学鉴定、免疫学鉴定、生物效应鉴定等。 分子生物学鉴定是目前应用于中药鉴定领域较多的一种生物鉴定方法。分子生物鉴定是依据携带遗传信息的大分子(核酸和蛋白)特征，应用分子标记技术鉴定中药。按鉴定特征可分为核酸分子鉴定和蛋白质分子鉴定两大类，由于DNA分子作为遗传信息的直接载体，具有较高的遗传稳定性和化学稳定性，核酸分子鉴定主要集中于DNA分子鉴定。常用的方法有DNA分子标记鉴定、DNA分子条形码鉴定、mRNA差异显示鉴定等，其中前两种方法在中药鉴定领域应用广泛，并收载于《中国药典》中。 DNA分子标志鉴定属于生物鉴定方法，DNA分子遗传标记技术直接分析生物的基因型，与传统的方法比较，具有下列特点：①遗传稳定性：DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，每一个体的任一体细胞均含有相同的遗传信息。因此，用DNA分子特征作为遗传标记进行物种鉴别更为准确可靠。②遗传多样性：DNA分子是由G、A、C、T四种碱基构成，为双螺旋结构的长链状分子，生物体特定的遗传信息便包含在特定的碱基排列顺序中，不同物种遗传上的差异表现在这4种碱基排列顺序的变化，这就是生物的遗传多样性。比较物种间DNA分子的遗传多样性的差异来鉴别中药的基原，通过选择适当的DNA分子遗传标记，能在属、种、亚种、居群或个体水平上对研究对象进行准确鉴别。③化学稳定性：DNA分子作为遗传信息的载体，除具有较高的遗传稳定性外，在诸多的生物大分子中，比蛋白质、同工酶等具有较高的化学稳定性。在陈旧标本中所保存下来的DNA仍能够用于DNA分子遗传标记的研究。 中药鉴定中常用的DNA分子标记技术：①限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，基本原理是物种的基因组DNA在限制性内切酶的作用下，在特定的核苷酸顺序上切割，产生相当多的大小不等的DNA片段，用放射性同位素标记的DNA探针检测与被标记DNA相关的片段，构建多态性图谱。该方法试验步骤繁琐，所需DNA样品量大，仅适于 DNA未明显降解的新鲜药材。②随机扩增多态性 DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)和任意引物PCR(AP-PCR)，其主要优点是适于未知序列的基因组DNA的检测。该方法已被广泛用于遗传指纹作图、基因定位、系统进化以及动植物、微生物物种及中药材的鉴定等各个领域。③扩增片段长度多态性标记(amplified fragment length polymorphic DNA marker，AFLP)，该方法反应灵敏、快速高效，指纹图谱多态性丰富、重复性好、特异性较高，可用来检测种和种以下水平的差异。不足之处是检测过程中如果使用放射性同位素，会对环境和人身安全构成一定的危害，所需仪器和试剂价格昂贵，试验成本较高。④DNA测序法(DNA sequencing)和基于DNA序列测定的PCR-RFLP、特异引物PCR方法，应用DNA测序法鉴定中药，不需要预先知道靶基因的序列信息，应用DNA测序技术建立正品药材和相关混伪品的原植、动物的基因序列数据库，用同样的方法对待测样品进行测序，与正、伪品数据库进行对照，即可对中药的真伪进行鉴定。但采用全序列比对的方法比较麻烦，故在此基础上发展了更加简便的PCR扩增特定片段的限制性位点分析(PCR-RFLP)和位点特异性鉴别PCR方法(diagnostic PCR)。前者是通过PCR扩增一段DNA片段，再选择适当的限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，可得到有种属特性的电泳谱带，从而达到品种鉴定的目的。后者是根据正品及其混伪品特定区域的DNA序列数据，设计有高度特异性正品药材的鉴别引物。当对待测样品进行鉴定时，从待测样品中提取少量的DNA为模板，用高特异性的鉴别引物在适当条件下进行PCR扩增，PCR产物用0.8%～1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如为阳性则为正品，否则属非正品药材，以达到鉴别药材真伪的目的。⑤简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence repeat，ISSR)标记技术是在简单重复序列(SSR)标记技术基础上发展起来的，扩增重复序列之间区域的DNA分析技术。ISSR也称作锚定SSR(ASSR)，是以微卫星为引物的PCR(MP-PCR)技术。其基本原理是用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的5′或3′端加上2～4个随机核苷酸构成锚定引物，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的SSR区域的多个产物凝胶电泳分离获得扩增指纹图谱，从而达到中药鉴定的目的。ISSR标记技术是一种用于分析物种、种群甚至是个体间遗传变异的理想方法。 DNA条形码鉴定是近年来基于分子标记技术发展起来的一种物种鉴定新技术，由加拿大分类学家Paul Hebert于2003年首次提出。该技术可以用于动物、植物和真菌物种的快速鉴定，实现门、纲、目、科、属、种、变种等不同分类水平物种的鉴定。该技术在中药鉴定领域推广应用，可大大提高中药鉴定的速度和质量，有力地促进中药鉴定技术的发展。①DNA条形码的定义：DNA条形码(DNA barcoding)是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段作为标记，对物种进行快速、准确、自动化的识别和鉴定的一种生物鉴定新方法。该方法通过筛选确定通用条形码，建立条形码数据库和鉴定平台，通过生物信息学分析方法分析比对DNA数据，进而对中药进行鉴定。②DNA条形码的原理：因为每个物种的DNA序列都是唯一的，DNA条形码通过测定基因组上一段标准的、具有足够变异的DNA序列来实现物种的鉴定。理论上这个标准的DNA序列对每个物种来讲都是独特的，每个位点都有A、T、C、G四种碱基的选择，15bp的DNA序列就有415种组合编码，从理论来讲完全可以编码地球上的所有物种。③DNA条形码筛选标准：并非所有的基因片段都适合作DNA条形码，适合作DNA条形码的基因一般应为标准的短DNA片段；序列的变异要适度，种间的差异幅度要足够大，便于区分鉴别不同物种，同时要具有相对的保守性，确保种内变异尽量小而稳定，使种间和种内变异有一个很明确的界定；序列两端相对保守，以便引物的设计。 DNA条形码在中药鉴定中的成功应用将带来中药鉴定方法的革命性突破。DNA条形码鉴定快速准确，重复性和稳定性高，有望实现中药鉴定标准化和自动化，克服传统鉴定法的诸多缺陷，是传统中药鉴定方法的有效补充。目前，DNA分子鉴定技术已被《中国药典》2015年版一部收载，用于蛇类药材的鉴别，如乌梢蛇、蕲蛇等。 |
