2.mRNA包封/装载及纯化
mRNA的非病毒递送系统主要包括但不限于基于脂质的递送系统（如核酸脂质复合物（lipoplexes）和阳离子脂质体等）、基于聚合物的载送系统（如polyplexes等）、基于脂质和聚合物的载体系统（如lipopolyplexex等）。mRNA包封/装载的过程一般系以聚阳离子材料或正电荷脂质等材料与mRNA复合（complexing）后直接成粒，或成粒后再经包覆形成核壳形结构的过程。制剂制备过程可能还包括后续纯化步骤，以去除未包封/装载的mRNA、游离的聚合物或脂质材料和/或包封过程中引入的有害物质。制备递送物质的工艺及其与mRNA的复合、颗粒成型等工艺系mRNA疫苗的关键工艺步骤，应说明mRNA的包封形式及递送系统选择的依据、包封工艺和复合物（如脂质体或纳米颗粒）纯化工艺的研究与优化。 包封工艺可能包括： （1）mRNA与阳性聚合物材料的复合阶段； （2）纳米颗粒制备及纯化阶段。 复合阶段关键工艺参数可能包括投料比（阳离子材料与mRNA的比率）、各个复合物料的反应浓度、缓冲体系及浓度、pH和复合时间等；应对阳离子聚合物材料和复合工艺进行筛选和优化，重点可考察氮磷比对复合率以及mRNA稳定性的影响等。应对复合中间体拟定适宜的过程控制及检定标准，如包封均一性等。 纳米颗粒形成阶段的关键工艺参数可能包括mRNA浓度、递送材料（尤其是阳离子材料）浓度、混合时的溶剂系统及流速、混合压力、纯化参数和除菌过滤等。建议关注纳米颗粒形成过程中及形成后的工艺过程对纳米颗粒的聚集或解散、mRNA泄露、mRNA完整性以及稳定性的影响，建议关注核酸/脂质比、电位等与mRNA稳定性以及转染效率、表达效率之间的关系。纳米颗粒质控方面应设置适宜的控制标准，如，mRNA含量、包封率、Zeta电位、粒度大小及分布和辅料组分含量及试剂残留等项目。 3.工艺确认 提供连续批次生产工艺的确认和评价资料，应至少包括检验分析和验证在该生产工艺条件下中间产物及成品的质量情况；工艺相关杂质和产品相关杂质去除效果等研究资料。
mRNA疫苗质量特性研究可参考已上市siRNA脂质纳米颗粒及纳米产品的相关技术指南。提供常规放行检验分析和采用先进的分析技术进行的质量研究和特性分析研究数据。特性分析通常包括结构特征（尤其与mRNA递送系统功能相关的结构属性）、纯度、杂质分析（工艺相关杂质及产品相关杂质）、体内外效力、免疫学特性等研究。除常规放行检验项目外，mRNA疫苗质量研究和特性分析研究资料应考虑开展以下研究，并鼓励对影响疫苗效力或安全性的其他结构特征开展研究。 在研发早期，应对样品进行初步结构确证，提交研究数据，完整的结构确证数据可在申报新药上市时提交；疫苗的生物效价研究是反映工艺性能和产品质量的综合指标，建议尽早开展相关研究。 在递送系统的质量特性研究中，应关注取样样品的代表性以及制样过程对样品实际状态的影响。 应对核酸序列正确性（包括影响疫苗稳定性、转录、翻译表达效率的关键元件）、mRNA浓度（紫外吸收）、mRNA修饰比例、加帽率、完整性、纯度、物理特性（如外观、pH值等）、mRNA体外翻译活性等特性进行分析。如可能，应评估构建的mRNA疫苗本身的免疫原性。 应基于制剂质量特性对产品功效的影响程度来确定表征的完整度和等级。建议对mRNA复合及成核效率、pH、复合率和/或包封率、平均粒径和粒径分布、粒子微观形态、Zeta电位、渗漏/释放的评价、mRNA和免疫增强剂在各磷脂含量/比例、成品中药脂比、装载和未装载mRNA量（药物在脂质体中的分布情况/存在状态）、未形成组装结构的聚合物材料和正电荷脂质材料、氮磷比、辅料杂质（尤其是含有不饱和双键的脂材，如DOPE、DLin-MC3-DMA的氧化/降解产物、合成聚合物相关杂质等）等进行分析研究。如适用，建议进行成核颗粒聚集度、PEG密度等表征研究。建议开展脂质纳米颗粒（LNP）质量属性（如粒径、粒径分布、电荷、包埋率）与免疫效果的相关性研究。mRNA释放性能与有效性密切相关，鼓励开展mRNA释放特征研究，如体外模拟释放、溶酶体pH环境下的释放性能等，可采用色谱、光谱等方法检测。 对于mRNA-递送系统的相互作用：建议结合递送系统与mRNA相互作用的结构或特性开展必要的质量研究，理化结构特性如等电点、递送材料的pKa值、粒径及其分布、颗粒形态、mRNA的包封率及分布、mRNA的泄露或释放等；生物学活性如佐剂或新的递送系统对mRNA递送效果、降低佐剂或抗原毒性和/或增强抗原免疫反应的相关研究，mRNA-递送系统复合物最终表达蛋白及其对免疫原性影响的研究等。 生产工艺、贮存、和/或用于保存原液的密封容器中产生的、和/或稳定性研究批次中发现的潜在杂质，包括工艺相关杂质和产品相关杂质。对于早期临床试验申请，可根据来源、风险及残留量的安全性水平等，列出潜在的杂质（建议结合毒理试验结果、文献资料、既往积累的认知信息等综合考虑），如mRNA相关杂质、DNA残留、蛋白质残留、递送物质相关杂质、颗粒相关杂质及生产工艺相关杂质等。对主要杂质进行监测与分析，必要时纳入质量标准和进行安全性初步评价。对于开发后期临床试验，除了早期临床试验申请提供的信息之外，还需进一步进行杂质的分离、鉴别等的分析。考虑其在生产和贮存期间是否显著增加及其与疫苗有效性的相关性，确定是否纳入过程控制或放行标准；对于需纳入质控体系的项目应随研究的逐步推进加强标准要求。对于药典收纳的检项，必须符合药典的标准。 mRNA产品相关杂质建议关注影响mRNA功能的截短序列（可能来源于转录不完全或mRNA的降解/断裂）、可能导致非特异性免疫反应的双链mRNA序列、加帽不完全的mRNA、帽子相关杂质、去磷酸不完全的mRNA、修饰过度的mRNA等；此外，需关注mRNA错配序列、mRNA氧化产物等。 由于DNA残留不同于传统疫苗细胞基质的DNA残留，系特定DNA序列的残留，应结合产物序列、残留量、残留DNA片段大小等评价DNA底物残留的安全性风险。 制剂相关杂质建议关注：（1）正电荷材料相关杂质，包括材料合成产生的杂质以及mRNA复合过程中可能产生的杂质；（2）不饱和脂质的氧化及相关降解产物；（3）纳米颗粒聚集产生的颗粒物；（4）未组装的脂质分子、阳离子物质；未包封的mRNA；在制剂及贮存过程中可能降解或失活的mRNA等。其中，未组装的脂质分子会影响LNP的稳定性；游离mRNA易降解，影响产品的有效性。 （四）生物学活性研究 体内效力试验：根据mRNA疫苗理论的免疫反应原理应评价其体液免疫和/或细胞免疫的生物活性。在评价体液免疫效价时，可使用中和抗体和/或总抗体检测方法。应尽可能选择与人体免疫效应具有相关性的实验动物。建立检测动物血清中和抗体和/或总抗体的方法，包括中和试验毒株、包被抗原、参比品的研究等。如有必要和可能，鼓励建立抗体性质的评价方法，如亚型测定、针对抗原中和位点的分析等。建议建立检测评价细胞免疫的方法（如利用细胞因子Elispot检测评价特异性CTL反应等方法）进行细胞免疫效价的评价。该类方法应至少具有支持临床期间变更评价的适用性及相应的质量标准。 体外活性检测（体外抗原表达量检测）：通常采用体外转染哺乳动物细胞、检测其表达量的方法。建议建立定量检测表达抗原的方法以及表达抗原的定量标准，并对该检测方法的敏感性以及定量的准确性进行验证；建议检测表达产物抗原谱，其各表达目的抗原的大小应与预计大小相同；鼓励建立相应的方法并经验证后拟定各表达抗原的量和图谱的质量控制标准。鼓励进行体外检测与动物模型中的免疫原性或有效性的相关性研究。 动物保护性试验：系最理想的临床前有效性评价手段之一，可结合药效学研究开展。 共表达基因序列的活性：若构建的基因序列除新型冠状病毒目的抗原序列外，还包括具有调节免疫反应功能的细胞因子序列或包含佐剂效应的序列，则应对这类分子进行详细分析，包括分子大小、表达量及免疫学反应等。若这种因子或佐剂效应序列未批准上市，则应对这类分子进行单独的药理和毒理学研究。
申报临床时可根据工艺确认资料初步确定质量标准；上市阶段应按照相关指导原则进行风险控制分析并结合工艺验证情况提供完整的质量标准。以下检定项目均为建议的检定项目，早期阶段可作为内控项目积累数据，上市阶段根据研究数据确定是否纳入放行标准；对于一般工艺相关杂质，如经充分验证证明工艺可对其有效、稳定地清除，可结合工艺进行控制，相关残留物检测可不列于检定项目中。 建议考虑以下质控项目：鉴别、DNA模板浓度/含量、测序、纯度、线性效率（如适用）、杂质残留、微生物限度、内毒素等检测。鼓励申请人建立DNA转录模板体外转录活性的质控。 转录模板中的杂质残留可能包括宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白残留等。 由于mRNA测序准确性不如模板DNA测序且受限于其转录长度，因此，为保证mRNA序列准确性，转录模板的测序是必需的。 建议考虑以下质控项目：mRNA鉴别、mRNA序列长度、序列完整性及准确性、mRNA理化特性（如pH、外观等）、mRNA含量、加帽率、纯度、产品相关杂质（如不完整mRNA、双链RNA等）、工艺相关杂质（如残留蛋白酶、DNA模板残留、有机溶剂、金属离子残留等）、无菌、内毒素等。 （三）制剂中间产物 应基于mRNA递送系统制备工艺的实际情况，定义制剂中间产物并建立中间体质量标准，可能包括mRNA与阳性聚合物材料复合后产物、纳米颗粒中间产物等。中间产物检测是过程控制的一部分，是否定义为中间产物及对应的检测要求应考虑以下因素：（1）该阶段是否为对应检测项目的最敏感阶段；（2）后续生产工艺、制剂处方对活性组分是否存在影响，如是否进行冻干；（3）后续工艺步骤是否需要该步检测，如活性成分含量用于指导配制。 建议考虑以下质控项目，包括物理特性、鉴别、含量、内毒素和无菌等评估。 （1）物理特性：包括pH、外观、纳米颗粒大小及分散系数（PDI）、Zeta电位等。 （2）鉴别：通过适当的方法进行确认，如测序、电泳、高效液相色谱等。 （3）含量检测：包括核酸浓度、mRNA包封率检测，可采用A260法或荧光分析法等适宜方法进行检测。 （4）工艺相关杂质残留。 （5）安全性相关分析：包括内毒素、无菌检查。
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