北航教授研发纳米芯片，30分钟即可解析肺癌细胞基因突变

高山仰止

     近日，国际癌症研究机构（IARC）报告了全球最新癌症数据：每新增 4 名癌症患者，就有 1 名来自中国，每分钟有将近 8 名中国人确诊患癌。
     对肿瘤患者来说，一旦肿瘤细胞出现特殊行为，细胞就有可能出现超强耐药性，这时无论服用再昂贵的药物，也可能是无济于事。
     研究发现，特定细胞的基因发生突变，往往是导致上述现象的主要原因。因此，在单细胞水平上，研究活细胞行为和基因突变的相关性，可帮助提供更精准可靠的临床治疗参考。
     基于此，北京航空航天大学常凌乾课题组开发出一种新型单个活细胞水平研究平台（Single Living Cell Analysis Nanoplatform，下称 SLCA 平台），借助纳米电递送技术，该平台可将一种用于原位信号放大的多米诺荧光探针，高效递送到活细胞内，从而在单细胞水平检测细胞内的基因突变。同时，该研究中基于微孔阵列的纳米芯片，拥有细胞寻址的能力，它能对肿瘤细胞进行耐药性原位分析。
     2021年4 月 8 日，Nano Letters 刊登了相关论文，论文题为 “Single Living Cell Analysis Nano-platform for High-throughput Interrogation of Gene Mutation and Cellular Behavior” 《用于基因突变和细胞行为高通量探测的单个活细胞分析纳米平台》，并成为Nano Letters 内封面文章。
     其中，常凌乾担任通讯作者，第一作者是北航生物医学工程高精尖创新中心和生物医学工程学院董再再博士。
     
     常凌乾团队利用 SLCA 平台对肺癌患者临床样品进行了综合分析，发现肺癌细胞的 EGFR 基因突变和相关靶向药物耐受性之间，存在明显的正相关性。也就是说，细胞对靶向药的敏感程度、和引起肺癌的某些基因突变细胞，呈现出比例上的正相关性。
     因此，SLCA 平台可为细胞内基因检测和单细胞分析提供一种通用方法，并有望大范围用于指导临床精准治疗。
     据了解，在肺癌基因突变中，EGFR（epidermal growth factor receptor）作为表皮生长因子受体家族的成员之一，其发生突变的存在率最高。虽然 EGFR 靶向药物可以延长肺癌患者存活期，但肿瘤细胞容易产生耐药性，而这会导致靶向药物失效。因此，预估患者体内是否发生 EGFR 突变，并借此推断患者的肿瘤细胞对于靶向药物的耐药性，可有效提高肺癌治疗效果。
     研究中，常凌乾团队设计出一种 DNA 探针，名字叫 Domino（下称多米诺）。通过碱基互补配对的原则，这只探针可把成对的发夹 DNA 序列，组装成致密的螺旋链。与靶 RNA 孵育后，多米诺探针会在 30 分钟内快速反应，并使其荧光倍率增强，最终实现在单细胞内具有较强的荧光检测信号。
     在目标 RNA 存在的情况下，由于链在螺旋方向上的链置换反应，多米诺探针被迅速触发，并在 30 分钟后，荧光强度会达到饱和。与传统的分子探针相比，多米诺探针的反应速度快了 4 倍，并能将荧光信号放大 12.5 倍。
     为了实现高效、且安全的探针传递，同时允许在单细胞水平上、对细胞行为进行原位观察，常凌乾课题组开发出一种纳米芯片，该芯片可将多米诺探针传递到活细胞中，并可在芯片上进行细胞培养与观察。如下图所示，从上到下来看，该纳米芯片由三个部件组成：分别是用于细胞定位和培养的微孔阵列、用于探针输送的纳米孔、以及用于建立电场的电极。
     其中，这些微孔阵列膜可被分为上腔和下腔，相关细胞和多米诺探针均会通过带有纳米孔的微孔阵列膜。数以百万计的单细胞排列在微孔阵列中，并与微孔底部的纳米孔紧密相连。在外部低电压下，纳米孔会聚集电场，并在纳米孔之间形成偏置电压，从而穿透细胞膜。通过使用此方法，可以巧妙避免同电荷细胞膜与多米诺探针之间的斥力问题，还能在可调节的电场下实现单细胞膜上的精确电穿孔，可控、高效、均匀地将多米诺探针传递进细胞。此外，在芯片上，每个微孔都有一个唯一的地址，这样就能联合多米诺探针检测并追踪微孔中的每个细胞。

     相比传统的分子信标（Molecular beacon，一种荧光标记的寡核苷酸链，但没有荧光信号放大功能），在同样条件下，多米诺探针明显增加了输出荧光，它的检出限比传统分子信标低 100 倍，这说明多米诺探针在敏感的基因突变检测方面，具备一定优势。
     为了对样品进行平行测试，团队在一个芯片上设计了三个平行的模块，每个芯片单元在聚碳酸酯纳米膜上制备有 10000 个微孔，从而实现高通量的细胞分析。每个微孔只有 20μm 大小，为的是能适应大多数细胞的尺寸。研究中，他们采用纳米孔直径为 800nm 的纳米孔膜，将电场定位到细胞膜上，随后通过穿孔细胞膜，并利用电泳方式，将多米诺探针送到细胞中。
     为了定位芯片上的每个单元，纳米孔膜上的微孔被划分成一个个 10×10 微孔的方形阵列，并使用数字进行标记。例如，标记为 “4−9_J-5” 的微孔，位于纳米孔膜的第四行和第九列。也就是说，即使芯片被重新安置，任何单个细胞也都能被寻址。
     此外，当这些细胞排列成大规模的规则阵列，也可为后续基因分析和细胞行为的跟踪，提供精确的单细胞分析平台。由于这些癌细胞都位于可寻址微孔中，因此在递送之后，可实现细胞里的 EGFR 基因突变检测，以及后续的耐药性分析。
     即使在 10V 的低电压下，多米诺探针也能穿透细胞膜。另外，常凌乾团队还比较了单个细胞在不同微孔和 BEP 中的跨膜电位。由于微孔所提供的环境是均匀的，因此微孔中的细胞具备几乎相同的跨膜电位，相比传统的电穿孔方法（bulk electroporation），优势非常明显。
      这一结果表明，基于微孔阵列的导电纳米芯片，能为每个细胞提供均匀分布的电场，这对于微孔中细胞的均匀电穿孔是非常必要的，也是实现多米诺探针均匀导电的前提条件。

     研究中，常凌乾团队分别选取了三种类型的肺癌细胞 H1975、HCC827 和 A549，来作为 EGFR L858R 突变阳性、EGFR 19 外显子缺失突变阳性、以及 EGFR 突变野生型的模型。考虑到高检测信号和低细胞损伤的要求，他根据多米诺探针和碘化丙啶在细胞中的荧光强度，确定了 10 V 和 200 个脉冲作为最佳电传递条件。
     他们发现，用电递送纳米芯片将多米诺探针注入细胞，30 分钟内突变细胞就会变亮。这些结果证实，组装的多米诺探针在不影响累积率的情况下，实现了细胞内目标 RNA 的荧光检测。     
     流式细胞仪的结果也表明，本次研究中的纳米平台，可区分 90% 以上的突变阳性细胞。

图 | 可区分 90% 以上的突变阳性细胞（来源：受访者）

     考虑到所有细胞都可以在微孔阵列上直接被观察到的特性，常凌乾团队对变亮的细胞进行计数，得出突变阳性细胞的比例。对比后他们发现，细胞的突变阳性率与流式细胞仪计数的结果一致，这表明该纳米平台具有高通量、单细胞分辨率的基因分析能力。
     为了获得较高的加载效率，该团队还应用一种基于真空的设置，来将细胞加载到微孔中，从而让细胞效率达到 85% 以上。此纳米平台的递送效率和细胞活性均达到 90% 以上，这也表明它在活细胞操作、探针递送和细胞行为分析方面，具有很高的可行性和良好的性能。
     概括来说，该研究工作研发了一种纳米生物芯片，在原位进行高通量活细胞培养，并在活细胞内探测突变基因，以及时空可控的分析同一细胞行为。未来有望能通过技术转化，应用于临床药物筛选和精准医疗。这也是常凌乾从事科研的一个长期愿景。
     谈及未来，他说，国家十四五规划已明确将单细胞技术、创新药物作为优先发展领域。能在单细胞精度解析细胞的技术，是未来生物技术领域的重点之一。他们课题组将继续致力于设计新型的可以在单细胞精度上操控和改造细胞的新技术，并为未来能直接应用于临床诊断和在体治疗而奋斗。（深科技）