本标准规定了食品中维生素Br2的测定方法。
第一法液相色谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品中维生素Br2的测定。
第二法液相色谱-质谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果冻、饮料中维生素B12的测定。
第三法微生物法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品中维生素B12的测定。
第一法液相色谱法
2原理
试样经酶解后,用氰化钾(或氰化钠)溶液将钴胺素异构体(羟钴胺素、甲钴胺素和5-脱氧腺苷钴胺素等)转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后,反相液相色谱柱分离,紫外检测器检测,外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一-级水。
3.1试剂
3.1.1无水乙酸钠(CH3COONa)。
3.1.2乙酸(CH3COOH)。
3.1.3甲醇(CH3OH):色谱级。
3.1.4乙腈(CH3CN):色谱级。
3.1.5三氟乙酸(CF3COOH):色谱级。
3.1.6氰 化钾或氰化钠( KCN/ NaCN)。
3.1.7胃蛋白酶(CAS号:9001-75-6,活力≥400 U/mg)。
3.1.8淀粉酶(活力≥50 U/mg)。
3.1.9乙醇(C2H6O)。
3.2试剂配制
3.2.1乙醇溶液(25%):量取250 ml乙醇,加水稀释至1 000 mL混匀。
3.2.2乙 酸钠缓冲液(0.25 mol/L):称取20.5 g无水乙酸钠,用950 ml水溶解并用乙酸调pH至4.0士0.1,用水稀释至1 000 mL。
3.2.3氰化钾(或氰化钠)溶液(10 mg/mL):称取1.0 g氰化钾(或氰化钠)固体,加适量水溶解,并用水稀释至100 ml。
注:氰化钾(或氰化钠)为剧毒化学品;操作者须带防护用具,在通风橱内进行氯化钾(或氯化钠)溶液的配制或使用。
3.2.4三 氟乙酸溶液(0.04%,体积比):量取500 ml水,加入200 μL三氟乙酸,混匀。
3.3标准品
维生素B12 (氰钴胺素)标准品(C63H88 CoN14O14P,CAS号:68-19-9):纯度≥99% ,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
3.4标准溶液配制
3.4.1维生素 B12标准储备液(1 mg/mL):称取10 mg(精确至0.01 mg)维生素Br2 标准品于50ml烧杯中,用乙醇溶液溶解后,转移至10 mL容量瓶中,用乙醇溶液定容至刻度，摇匀,转移至棕色试剂瓶，于一20 °C下避光保存,有效期6个月。
3.4.2维生素 B12标准工作液(10μg/ml):吸取1.00 ml维生素B12标准储备液,置于100 ml容量瓶中,用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中,于4 ℃下避光保存,有效期1个月。
3.4.3维生 索B12标准系列工作溶液:准确吸取标准工作液30μL、60μL、90μL、150μL和200μL,分别置于10 ml容量瓶中,用水定容至刻度。其浓度分别为:30 ng/ml、60 ng/mL、 90 ng/ml、150 ng/mL和200 ng/ml。临用现配。
3.5 材料
3.5.1维生素 B12 免疫亲和柱,柱容量≥800 ng,柱回收率≥85%(验证方法参见附录A)。
3.5.2玻璃纤维滤纸。
3.5.3微孔滤膜:水相,0.22μm。
4仪器和设备
4.1液相色谱仪:带紫外检测器。
4.2天平 :感量为0.01 g、0.001 g和0.00001 g。
4.3 pH计:精度0.01。
4.4水浴恒温振 荡器:温度范围25 ℃~100℃。
4.5超声波清洗器。
4.6 离心机:转速≥10 000 r/ min。
5分析步骤
注:操作过程应避免紫外光照,并尽可能避光操作。
5.1样品前处理
5.1.1试样制备
固体样品粉碎、研磨,或用绞肉机制成食糜,均质混匀。液体样品试验前振摇混匀。
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发表于 2024-2-29 12:33:45
